Способ получения позитивной овисной сыворотки для диагностики инфекционного эпидидимита баранов

(51) 61 39/10 (2009.01) 12 1/20 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ антигенов, иммунизацию баранов-доноров, взятие и обработку крови с последующим выделением и стерилизацией сыворотки, при этом в качестве антигена используют смесь 100 млрд. взвесей культур бруцелл штаммов 424 и 10,выращенных в биологических реакторах на жидкой питательной среде следующего состава панкреатического гидролизата мяса с содержанием до 150 мг аминного азота - 80 неполного панкреатического гидролизата казеина с содержанием до 150 мг аминного азота - 15-16 пептона - 1 аминокислоты цистин - 0,03 сухого дрожжевого экстракта - 0,25 глицерина - 1 глюкозы - 1,3 1-0,03, в течение 20-24 часов при аэрации,иммунизацию осуществляют трехкратно, подкожно, с интервалом 5-7 дней,введением 2 см 3 антигена в смеси с равным объемом геля гидроокиси алюминия во внутреннюю область конечностей, причем при третьей иммунизации дополнительно вводят внутривенно 1,0 см 3 антигена, а взятие крови осуществляют через 14 дней после последнего введения антигена. Способ позволяет повысить активность готового продукта, снизить трудомкость и себестоимость процесса производства.(72) Шеремет Юлия Дмитриевна Иванов Николай Петрович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЗИТИВНОЙ ОВИСНОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА БАРАНОВ(57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве позитивной овисной сыворотки для диагностики инфекционного эпидидимита баранов. Способ получения позитивной овисной сыворотки для диагностики инфекционного эпидидимита баранов, включает изготовление 18833 Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве позитивной овисной сыворотки для диагностики инфекционного эпидидимита баранов. Известен способ получения позитивной овисной сыворотки для диагностики инфекционного эпидидимита баранов, включающий изготовление антигена, иммунизацию животного-донора, взятие и обработку крови с последующим выделением и стерилизацией сыворотки, заключающийся в иммунизации некастрированных барановпродуцентов в возрасте от 1 до 3 лет антигеном в виде живой агаровой культуры производственных штаммов .10/1 и 424/1 на физиологическом растворе, взятыми в равных объемах по следующей схеме первый раз заражают внутривенно и подкожно (внутривенно в яремную вену вводят взвесь микробных клеток и одновременно ее вводят подкожно в область мошонки) второй раз животных заражают только подкожно. Через 10-15 дней после 2-й инъекции антигена у животных берут кровь для определения титра антител в сыворотке. При удовлетворительных результатах у баранов берут кровь 2 раза в месяц для производственных целей из расчета 8-10 мл крови на 1 кг массы животного(Ветеринарные препараты. Справочник //Сост. Борисович Ю.Ф., Кириллов Л.В./под ред. Осидзе Д.Ф. -М. Колос, 1981, с. 264-266). Недостатком способа является дороговизна способа и недостаточная эффективность конечного препарата при диагностике бруцеллеза(инфекционно эпидидимита) баранов. Целью изобретения является повышение активности,снижение стоимости готового препарата. Задачей изобретения является разработка способа получения позитивной овисной сыворотки для диагностики инфекционного эпидидимита баранов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении активности готового препарата, снижении трудомкости и себестоимости процесса производства. Сущность изобретения. Способ получения позитивной овисной сыворотки для диагностики болезни овец,вызываемой(инфекционный эпидидимит баранов) заключающийся выращивание бруцелл штаммов 424 и 10 на жидкой питательной среде в биологических реакторах, трехкратной иммунизации барана антигеном, приготовленным из смеси 100 млрд. взвесей культур бруцелл,причем первоначально антиген вводят в равной смеси с гелем гидроокиси алюминия подкожно, во внутреннюю область четырех конечностей, трехкратно, с интервалом 5-7 дней, а затем, во время третьей иммунизации одновременно осуществляют внутривенное введение 1,0 мл антигена (без геля), с взятием крови через 2 недели, и при достижении достаточного титра, отделением и инактивацией сыворотки. 2 Позитивная овисная сыворотка применяется для контроля ПРА(пластинчатой реакции агглютинации) и РДСК до серологических тестов при исследовании неизвестных сывороток на болезнь овец,вызываемой(инфекционный эпидидимит баранов). Способ получения сыворотки для диагностики болезни овец,вызываемой(инфекционный эпидидимит баранов) осуществляется следующим образом. Пример. 1. Техника изготовления овисного антигена для иммунизации животных-доноров. Изготовление антигена осуществляют из производственных штаммов(10 и 424),которые должны отвечать изложенным при описании характерных признаков бруцелл разной видовой принадлежности. Для изготовления овисного антигена в качестве посевного материала используют сухую или выращенную на косяке агара эталонную культуру. Для получения посевного материала в ампулу или пробирку с культурой наливают стерильный физиологический раствор до первоначального объема. После полного растворения микробной массы из взвеси готовят 10-кратные разведения в пробирках до 107 -109, в которые перед разведением разливают стерильный физиологический раствор в количестве 4,5 см 3. Из двух последних разведений производят посевы по 0,1 см 3 на 3-5 чашек Петри с питательным агаром. Чашки с агаром перед посевом предварительно подсушивают в термостате при 3738 С в течение 24 часов. Микробную взвесь,засеянную на чашки, равномерно распределяют по поверхности агара и выдерживают в термостате при 37-38 С в течение 4-6 суток. Посевы просматривают на чистоту и типичность роста колоний. Из чашек отбирают типичные колонии, которые отсевают на пробирки с одной из названных питательных сред. Выращенная в течение 3 суток при 37-38 С культура является исходным посевным материалом,для производственного засева. Выращенную культуру бруцелл штамма 424 и 10, смывают с косяка физиологическим раствором и высевают в биологический реактор на жидкую питательную среду следующего состава панкреатического гидролизата мяса с содержанием до 150 мг аминного азота - 80 неполного панкреатического гидролизата казеина с содержанием до 150 мг аминного азота - 15-16 пептона - 1 аминокислоты цистин -0,03 сухого дрожжевого экстракта - 0,25 глицерина - 1 глюкозы -1,3 -0,03, выращивают в течение 20-24 часов при аэрации, после этого выращенную культуру проверяют на чистоту, типичность роста,затем культуру освобождают от примеси питательной среды путем центрифугирования,разводят стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором с рН 7,0-7,2, доводя до концентрации 100 млрд. м.к./см 3 и смешивают в соотношении 11. 18833 Полученный описанным методом антиген проверяют на чистоту и стерильность путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму и Козловскому, и высева на МПБ, МПА, печеночномартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро - по две пробирки и два флакона с 50 мл бульона на каждый образец. За высевами наблюдают в течение 10 дней. При отсутствии посторонней микрофлоры приготовленный антиген считается пригодным для гипериммунизации животных. Хранится антиген в течение 2-3 недель при температуре 2-8 С. 2. Техника получения сыворотки. В качестве продуцентов отбирают здоровых баранов 3-4 лет массой 35-50 кг. Животных предварительно выдерживают в карантине и исследуют на инфекционные заболевания согласно действующим Основным ветеринарным правилам при заготовке животных в биологической промышленности. Баранов,оказавшихся здоровыми,переводят из карантина для эксплуатации. Далее баранов иммунизируют антигеном,который вводят в равной смеси с гелем гидроокиси алюминия в четыре конечности, подкожно, во внутреннюю часть бедренной и плечевой области,трехкратно,с интервалом 5-7 дней,(приготовленный из 100 млрд. взвеси в 1 см 3) в 0,9 растворе натрия. Первоначально животным вводят антиген с гелем в общем объеме 8 мл (по 2 см 3 на каждую конечность). Иммунизацию осуществляют трехкратно, с интервалом 5-7 дней. При третьей иммунизации осуществляют одновременное внутривенное введение антигена (без геля) в дозе 1,0 см 3 в яремную вену (приготовленный из 100 млрд. взвеси в 1 см 3). Через 14 суток проводят эксфузию крови,отделяют сыворотку. В процессе эксплуатации за 23 дня до производственного крововзятия проводят пробное крововзятие для определения титра сыворотки. После крововзятия цилиндры с кровью ставят в термостат на 1 -2 часа при температуре 37 С, потом при комнатной температуре на 3-4 часа (для отделения сыворотки), затем помещают в наклонном положении в холодильник при температуре 2-8 С. На 2-е сутки, производят 1-й слив сыворотки, на 3 - второй. Сыворотку от каждого барана отдельно инактивируют прогреванием при 56 С в течение 30 минут, консервируют 5-ным раствором фенола на физиологическом растворе в соотношении 110 (10,0 см 3 5-ного раствора фенола и 90,0 см 3 сыворотки) и ставят на 10 дней при температуре 2-8 С, для отстоя. Затем берут пробу сыворотки из каждой бутыли и подвергают проверке на стерильность путем высевов на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро и на активность в РА и РСК. Через 10 суток при условии стерильности и получении положительных результатов в РА и РСК сыворотку смешивают для составления серии. Под серией позитивной сыворотки для диагностики инфекционного эпидидимита баранов следует понимать количество препарата, смешанное в одной емкости, подвергнутое дальнейшей обработке в одних производственных условиях,расфасованное в ампулы или флаконы, получившее свой номер, номер госконтроля и оформленное одним документом о качестве. Полученная сыворотка для диагностики инфекционного эпидидимита баранов - желтоватая,слегка опалесцирующая жидкость, при стоянии образованием незначительного беловаого осадка,легко разбивающегося при встряхивании. Изготовленная серия овисной сыворотки должна быть стерильной,не обладать антикомплементарными свойствами и в разведениях 15 и 110 вызывать задержку гемолиза эритроцитов с оценкой в 4 креста контрольным овисным антигеном в разведении 1100 и в 3-4 креста с тем же антигеном в разведении 1200. Кроме того, в разведении 120 сыворотка должна вызывать задержку гемолиза эритроцитов в 3-4 креста с теми же разведениями антигена (1100, 1200). При этом во всех разведениях овисной сыворотки с бруцеллезным антигеном должен быть отрицательный результат. Специфический титр полученной по предлагаемой методике сыворотки составляет в среднем в 1 мл не менее 2000 международных единицантител, тогда как по старой методике в среднем 1000 международных единицантител. Таким образом, заявленный способ имеет значительные преимущества перед известным по снижению трудоемкости, себестоимости и срокам получения при достижении высоких титров готового препарата. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения позитивной овисной сыворотки для диагностики инфекционного эпидидимита баранов, включающий изготовление антигенов, иммунизацию баранов-доноров, взятие и обработку крови с последующим выделением и стерилизацией сыворотки, отличающийся тем, что в качестве антигена используют смесь 100 млрд. взвесей культур бруцелл штаммов 424 и 10, выращенных в биологических реакторах на жидкой питательной среде следующего состава панкреатического гидролизата мяса с содержанием до 150 мг аминного азота - 80 неполного панкреатического гидролизата казеина с содержанием до 150 мгаминного азота - 15 - 16 пептона - 1 аминокислоты цистин -0,03 сухого дрожжевого экстракта - 0,25 глицерина - 1 глюкозы - 1,3- 0,03, в течение 20-24 часов при аэрации,иммунизацию осуществляют трехкратно, подкожно, с интервалом 5-7 дней,введением 2 см 3 антигена в смеси с равным объемом геля гидроокиси алюминия во внутреннюю область конечностей, причем при третьей иммунизации дополнительно вводят внутривенно 1,0 см 3 3 18833 антигена, а взятие крови осуществляют через 14 дней после последнего введения антигена.