Ферментный препарат для определения концентрации глютамата

(51) 61 38/43 (2006.01) 61 36/899 (2006.01) 01 30/96 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ клинической диагностики, анализа пищевых продуктов и аналитической биохимии, касается разработки ферментного препарата на основе ферментного комплекса (ФК), состоящего из малатдегидрогеназы(ГОАТ) для определения концентрации глютамата в клинической диагностике и в продуктах детского питания. Задача изобретения - получить сравнительно недорогой стабильный ферментный препарат с высокой чувствительностью к глютамату. Поставленная задача достигается путем получения ферментного препарата на основе ФК МДГ-ГОАТ из эндоспермальной фракции семян пшеницы, очищенного с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе и гельхроматографии на колонке с Сефакрилом -300. Таким образом, ферментный препарат на основе ФК МДГ-ГОАТ рекомендуется для использования в клинической диагностике и в продуктах детского питания.(72) Гильманов Мурат Курмашевич Ригер Наталья Георгиевна Карабалин Арман Балтабаевич Кастер Керимкулова Макпал Рыскуловна Габдурахманова Гульнара Жумабековна Филимонова Ольга Валерьевна Адильбаева Алтынай Болатовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮТАМАТА(57) Ферментный препарат для определения концентрации глютамата относится к области Изобретение относится к области клинической диагностики, анализа пищевых продуктов и аналитической биохимии, а именно разработки ферментного препарата на основе ферментного комплекса (ФК), состоящего из малатдегидрогеназы(ГОАТ) для определения концентрации глютамата. Известно получение ферментного препарата оксидазы аминокислот из яда гюрзы, применяемой для определения -глютамата (А.А. Тара,Э.Э. Аавиксаар, В.Ю. Арве, Ю.Р. Сийгур. Способ выделения оксидазы аминокислот из яда гюрзы// патент 1055769 А от 23.11.83 г., Бюл.43) путем внесения этого ферментного препарата и определения количества кислорода с помощью стандартных методов полярографии или окислительно-восстановительных индикаторов солей тетразолия или дихлорфенолиндофенола( //. -1996. . 14. р.94-102). Недостатком этого метода является малая чувствительность к -глютамату оксидазыаминокислот. Известно определение -глютамата с помощью глютаматдегидрогеназы из печени быка (кат.2626 ) (Асатиани Ферментные методы анализа// Изд-во М. Наука, 1969 г.), ( , С.// .. . .- 1966. -.22. р.100-105). Недостатком этого метода является высокая стоимость препарата,сравнительно низкая чувствительность к-глютамату, а также нестабильность фермента и большая зависимость от присутствия нуклеотидов, других аминокислот,стероидов и ионов металлов, что ухудшает получение надежных и воспроизводимых результатов. Задачей изобретения является возможность получить сравнительно недорогой стабильный ферментный препарат с высокой чувствительностью к глютамату. Поставленная задача достигается путем получения ферментного препарата на основе ферментного комплекса,состоящего из малатдегидрогеназы и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы,из эндоспермальной фракции семян пшеницы,очищенного с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе и гельхроматографии на колонке с Сефакрилом -300. Ферментный препарат на основе ФК МДГ-ГОАТ имеет молекулярную массу 110 килоДальтон и состоит из 2-х субъединиц 50 кДа и бОкДа соответственно. Для получения ферментного препарата семена пшеницы размалывали на мельнице, просеивали через сито и брали эндоспермальную фракцию семян, которую гомогенизировали в заранее охлажденном 0,05 М трис -фосфатном буфере,рН 7,4. Гомогенат центрифугировали при 10 000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Супернатант подвергали ионообменной 2 хроматографии на колонке с ДЭАЭ целлюлозой типа ДЕ-52 Сервацел фирмы Серва (Германия),уравновешенной 0,05 М трис -фосфатным буфером,рН 7,4. После смыва несвязавшихся белков проводили ступенчатую элюцию КС 1, растворенном в стартовом буфере. Ферментный комплекс элюировался 0,15 М КС 1. Для дальнейшей очистки использовали гель-хроматографию на колонке с Сефакрилом -300 фирмы Фармация (Швеция),уравновешенной 0,05 М трис - фосфатным буфером,рН 7,4. Ферментный препарат элюировался в пике,который соответствует пикам белков с молекулярной массой 110 кДа. Пример 1. На фиг.1, представлены результаты очистки ферментного препарата на основе МДГ-ГОАТ из семян пшеницы с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ целлюлозой типа ДЕ-52 Сервацел фирмы Серва (Германия),уравновешенной 0,05 М трис -фосфатным буфером,рН 7,4, где ферментный комплекс элюировался 0,15 М КС 1. Пример 2. На рисунке 2, представлены результаты очистки ферментного препарата на основе МДГ-ГОАТ из семян пшеницы с помощью гель хроматографии на колонке с Сефакрилом -300 фирмы Фармация(Швеция), уравновешенной 0,05 М трис - фосфатным буфером, рН 7,4. Пример 3. На рисунке 3 представлен калибровочный график определения концентрации глютамата с помощью ферментного препарата на основе ФК МДГ - ГОАТ из семян пшеницы. Пример 4. Очищенный препарат ФК МДГ - ГОАТ используют в качестве ферментного препарата. Для этого необходимо приготовить реакционную смесь следующего состава 1,1 мМ НАД, 12 мМ малат,трис - фосфатный буфер, рН 7,7. Для количественного определения глютамата к полной реакционной смеси добавляют 0,2 мл испытуемой пробы (кровь, моча, слюна, околоплодная жидкость или строго разведенные растворы пищевых полуфабрикатов) и определяют активность ФК МДГ- ГОАТ на спектрофотометре при длине волне 340 нм в течении 1-2 минут. По полученной активности на калибровочном графике определяют точную концентрацию анализируемого вещества в испытуемой биологической жидкости, рассчитанной на 1 мл пробы. Установлено, что на активность ФК не влияют ионы 1 и 2-х валентных металлов, ионы цинка и ртути. Установлено, что в ферментном препарате отсутствуют эссенциальные сульфгидрильные группы, что делает его очень удобным для определения концентрации глютамата. Установлено, что нуклеотиды АТФ, АДФ, АМФ,ГТФ, ГДФ, ГМФ и различные протеиногенные аминокислоты не оказывают влияние на активность ФК. Установлено, что очищенный растворенный препарат ФК лучше всего хранится при температуре-15 С в течение нескольких месяцев без потери активности. Лиофильно высушенные препараты ФК могут храниться в обычном холодильнике до 1-го года без существенной потери активности. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Ферментный препарат для определения концентрации глютамата, включающий выделение фермента из биологического сырья гомогенизацией и хроматографической очисткой, отличающийся тем, что используют ферментный комплекс,состоящий из малатдегидрогеназы и оксалоацетатаминотрансферазы (МДГ-ГОАТ) из эндосперма семян пшеницы. 2. Ферментный препарат для определения концентрации глютамата по п.1, отличающийся тем, что для очистки ферментного комплекса малатдегидрогеназы и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы,эндоспермальную фракцию семян пшеницы гомогенизируют в охлажденном 0,05 М трисфосфатном буфере рН 7,4, затем гомогенат центрифугируют при 10000 об. в минуту в течение 10 минут,далее супернатант подвергают ионообменной хроматографии на колонке ДЭАЭ,для дальнейшей очистки элюированного ферментного комплекса используют гель хроматографию на колонке с Сефакрилом -300.