Ферментный препарат для определения низких концентраций ионов аммония

(51) 01 21/78 (2012.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ разработки ферментного препарата на основе НАДФН-ГДГ для определения низких концентраций ионов аммония. Задачей изобретения - получить дешевый и стабильный ферментный препарат глютаматдегидрогеназы (ГДГ), строго зависимой от пиридинового кофермента - восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН),имеющей высокую чувствительность к ионам аммония. Поставленная задача достигается тем, что получают ферментный препарат на основе НАДФН- ГДГ, очищенного гель - хроматографией из созревающих семян кукурузы или других злаковых культур на Сефарозе 2 В, 4 В или на углеродном сорбенте Нанокарбосорбе. Таким образом, ферментный препарат на основе НАДФН-ГДГ рекомендуется для использования в экологическом мониторинге природных водных источников на антропогенное загрязнение. Этот ферментный препарат также имеет перспективу для использования в клинической диагностике.(72) Гильманов Мурат Курмашевич Ибрагимова Саниям Ахметовна Гуккенгеймер Елена Юрьевна Ригер Наталья Георгиевна Керимкулова Алмагуль Рыскуловна Сафонов Дмитрий Павлович Нурмолдин Шалкар Мурзабекович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) В.В. Слепышева, М.Д. Балябина, А.В. Козлов Методы определения мочевины. //(54) ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ИОНОВ АММОНИЯ(57) Ферментный препарат для определения низких концентраций ионов аммония относится к области биохимии, биотехнологии и экологии, касается Изобретение относится к области биохимии,биотехнологии и экологии, касается разработки ферментного препарата на основе НАДФН глютаматдегидрогеназы (ГДГ) для определения низких концентраций ионов аммония. Известно определение ионов аммония в водной среде методом капиллярного электрофореза (М. В. Андреева, Г.Н. Ишевская, Г. Н. Сметанин Определение иона аммония методом капиллярного электрофореза //Аналитическая химия, ГУП Центр исследования и контроля воды, Санкт-Петербург 2, 2006, с.3-6) путем внесения пробы в капилляры и приложения к капилляру электрического поля. Детекцию аммония осуществляют путем измерения электропроводности. Этот метод требует дорогостоящего специального оборудования и чувствительность его не высока. Известно ионометрическое обнаружение ионов аммония с применением ион-селективных электродов и специальной ионометрической аппаратуры ( 2085927 С, 27.07.1997, 01 27/113). Этому методу присущ высокий предел обнаружения (более 25 мг/л ионов аммония),невысокая точность и необходимость использовать ион-селективные электроды, при этом точность и чувствительность метода в основном лимитированы конструкционными особенностями применяемых электродов и наличием в растворе мешающих ионов. Известно определение ионов аммония фотометрическим методом с реактивом Несслера(Руководящий документ РД 52.24.486-2009 Массовая концентрация аммиака и ионов аммония в водах. Методика выполнения измерений фотометрическим методом с реактивом Несслера// Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды (Росгидромет),Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации, Ростов-на-Дону 2009). Этот метод малочувствителен и реактив Несслера содержит ядовитые ионы ртути. Прототипом является определение аммония с помощью глютаматдегидрогеназы из печени быка(В.В. Слепышева, М.Д. Балябина, А.В. Козлов Методы определения мочевины. //. 2007, Т. 16). Недостатком этого метода является применение дорогостоящих лиофилизированных ферментов и высокий предел обнаружения. Задачей изобретения - получить дешевый и стабильный ферментный препарат глютаматдегидрогеназы (ГДГ), строго зависимой от пиридинового кофермента - восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН),имеющей высокую чувствительность к ионам аммония. НАДФН-никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный пиридиновый кофермент,имеющий в своей структуре амид никотиновой кислоты. НАДФН является необходимым низкомолекулярным компонентом фермента, без которого невозможно осуществление окислительновосстановительных реакций. 2 Поставленная задача достигается путем получения ферментного препарата на основе НАДФН - ГДГ, очищенного гель - хроматографией из созревающих семян кукурузы или других злаковых культур на Сефарозе 2 В, 4 В или на углеродном сорбенте Нанокарбосорбе. Ферментный препарат на основе НАДФН - ГДГ имеет сложнобелковую структуру. Он не обладает токсичностью и мутагенностью. В отличие от всех известных способов в работе не используются токсические и ядовитые вещества. Для получения ферментного препарата на основе НАДФН-ГДГ брали созревающие семена кукурузы и других злаковых культур пшеницы, ячменя и риса, собранных в фазу молочно-восковой спелости,которые растирали в фарфоровой ступке в 0,05 М морфолиноэтансульфанатном (МЭС) буфере 7,4,содержащим 0,1 восстановленного глютатиона. Гомогенат центрифугировали при 10000 х 10 минут. Ферментный препарат получали гельхроматографией полученного бесклеточного экстракта на колонке с Сефарозой 2 В, 4 В или с Нанокарбосорбом. Пример 1. На фиг.1, 3-5 представлены результаты хроматографии ферментного препарата на основе НАДФН-ГДГ из созревающих семян кукурузы на колонке с Нанокарбосорбом, где ферментный препарат выходил в первом высокомолекулярном пике. Фракции ферментного препарата на основе НАДФН-ГДГ используют для определения низких концентраций ионов аммония. Реакционная смесь состоит из 130 мкМ - НАДФН, 10 мкМ - сульфат аммония и 15 мМ - 2- оксоглютарат. Для анализа берут 0,2 мл очищенного НАДФН - ГДГ сферосом и добавляют в реакционную смесь без добавления в нее ионов аммония. Для детекции аммония берут 0,2 мл тестируемой воды из природного источника и определяют активность ферментного препарата при длине волне 340 нм в течение 1-2 минут. По полученной активности на калибровочном графике определяют точную концентрацию ионов аммония в испытуемой воде. Наличие ионов аммония свидетельствует об антропогенном загрязнении данного источника сточными водами и фекалиями. Пример 2. На фиг.2 представлен калибровочный график определения ионов аммония с помощью НАДФНГДГ из созревающих семян кукурузы. При изучении стабильности ферментного препарата было установлено, что его активность сильно подавляется в присутствии 3-х валентных металлов (алюминия и железа) и тиоловых ядов ионов кадмия, цинка, ртути и агента связывающегогруппы - пара-хлормеркурийбензоата (п- ХМБ). Для восстановления активности ферментного препарата после воздействия тиоловых ядов используют следующие агенты 2- меркаптоэтанол,дитиотреитол,британский антильюизит и восстановленный глютатион. Было установлено, что ферментный препарат может храниться без изменения исходной активности, при условии обязательного присутствия восстановленного глютатиона в концентрации 0,1 при температуре 10-15 С - в течение года, при температуре 05 С - в течение месяца, а при комнатной температуре - в течение одних суток. Таким образом, ферментный препарат на основе НАДФН - ГДГ используется для экологического мониторинга природных водных источников на раннее загрязнение канализационными стоками. Этот ферментный препарат также имеет перспективу для использования в клинической диагностике. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Ферментный препарат для определения низких концентраций ионов аммония, включающий фермент глютамат дегидрогеназу, отличающийся тем, что для определения микромолярных концентраций ионов аммония используют восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат зависимой глютамат дегидрогеназы из созревающих семян кукурузы или других злаковых культур.