Стандартный антиген вируса гриппа А/АstanaRG/6:2/09 (H5N1)- реагент для количественного определения гемагглютинина в реакции одиночной радиальной иммунодиффузии

(51) 61 39/145 (2010.01) 12 7/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ полученный путем ионообменной хроматографии. Очистку вируса проводили с помощью ступенчатого градиента 20-40-60 сахарозы. Вирусную фракцию собирали с зоны 40 сахарозы. Затем экстракцию гемагглютинина и нейраминидазы с поверхности вирусных мембран проводили путем обработки очищенного вируса неионным детергентом октилглюкозидом. Разделение гемагглютинина и нейраминидазы осуществляли методом анионообменной хроматографии с детергентом бромида цетримония. Во всех фракциях определяют нейраминидазную и гемагглютинирующую активность. Во фракции гемагглютинина определяют концентрацию белка. Чистоту и молекулярный вес выделенного НА рекомбинантного штамма вируса гриппа//62/2009 (51) определяли с помощью электрофореза в ПААГ-е. В результате электрофоретического анализа выделенного НА выявлено две субъединицы НА, молекулярные массы которых составляют НА 154,791 кДа,НА 227,660 кДа,которые соответствуют литературным данным. Исследования полученной фракции НА методом электронной микроскопии показали, что в препарате обнаружены гомогенные структуры в виде отдельных включений и структур,собранных в розетки. Полученный гемагглютинин с содержанием основного вещества 200 мкг/мл был разбавлен ФБР до 40 мкг/мл гемагглютинина и лиофилизирован.(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Хайруллин Берик Мухитович Касенов Мархабат Мелисбекович Волгин Евгений Николаевич Кондыбаева Жанат Буркитбаевна Нурпейсова Айнур Султановна Сарсенбаева Гульбану Жаксылыковна Богданов Николай Викторович Исагулов Тимур Еликович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Веселов С.Ю., Синяков М.С., Закомырдин Ю.А. Выделение препаративных количеств гемагглютинина вируса гриппа с использованием вируса гриппа с использованием метода аффинной хроматографии // Вопросы вирусологии, 1984, 1,с. 93-97(54) СТАНДАРТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГРИППА А/А/62/09(51) РЕАГЕНТ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНИНА В РЕАКЦИИ ОДИНОЧНОЙ РАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ(57) Изобретение относится к общей вирусологии и представляет собой стандартный антиген вируса гриппа штамма //62/2009 (51), 26358 ресуспендировали 0,05 М ФБР в 100 раз меньшем от исходного объема. Очистку сконцентрированного вируса проводили с помощью центрифугирования при 27000 об/мин в течение 1 часа через ступенчатый градиент 20-4060 сахарозы. Вирусную фракцию с зоны 40 сахарозы собирали и центрифугировали при 27000 об/мин в течение 1 часа для удаления сахарозы. Осадок ресуспендировали в ацетатном буфере в 200 раз меньшем от исходного объема. Затем экстракцию гемагглютинина и нейраминидазы с поверхности вирусных мембран проводили путем обработки очищенного вируса неионным детергентом октилглюкозидом. К очищенному вирусу добавляли октилглюкозид до концентрации 7. Экстракцию вели в течение 2 часов при 4 С, материал периодически встряхивая. После центрифугирования материала при 15000 об/мин в течение часа (ротор 50.1) супернатант, содержащий НА и , отбирали и хранили при -20 С. Разделение гемагглютинина и нейраминидазы осуществляли методом анионообменной хроматографии. К супернатанту, содержащему НА и, добавляли 2 водный раствор бромида цетримония(СТАВ,) до конечной концентрации в образце 0,1). Образец наносили на анионообменную колонку (13 см сорбентА-50),предварительно уравновешенную стартовым буфером. Так как значения изоэлектрических точеки НА вирусов гриппа могут различаться в зависимости от штамма, то значения рН стартового и элюирующего буферов для штамма(51) подбирали экспериментальным путем, используя значения буферов рН 7,0, рН 7,25, рН 7,5. Нейраминидаза элюируется в 20 мл стартовом буфере и собирается фракциями. Гемагглютинин элюируется в 20 мл элюирующем буфере и собирается фракциями. Каждая фракция диализируется против буферав течение 72 часов для удаления остатков октилглюкозида иХ-100. Во всех фракциях определяют нейраминидазную и гемагглютинирующую активность. Во фракции гемагглютинина определяют концентрацию белка. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 1. Таблица 1 Результаты выделения гемагглютинина вируса гриппа штамма //62/2009 (51) с использованием буферов с различных значений Изобретение относится к общей вирусологии и представляет собой стандартный антиген вируса гриппа штамм //62/2009 (51) для определения количественного содержания гемагглютинина в реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД). Известен стандартный антиген вируса гриппа штамма //7/09 (11) производства, полученный от вируса гриппа штамма(-179) инактивированного формалином. Данный стандартный антиген служит для количественного определения содержания гемагглютинина в полуфабрикате вакцины вируса гриппа 11. Содержание гемагглютинина в стандарте составляет 50 мкг/мл. Используя стандартный антиген//7/09 можно определить содержание гемагглютинина только в штаммах с общей формулой 11, при определении же содержания гемагглютинина в штаммах гриппа птиц с формулой 51 использование данного анитигена является не приемлемым (Веселов С.Ю., Синяков М.С.,Закомырдин Ю.А Выделение препаративных количеств гемагглютинина вируса гриппа с использованием метода аффинной хроматографии // Вопросы вирусологии, 1984, 1, с.93-97). Задача изобретения - получение стандартного антигена вируса гриппа штамма(51) с известным количественным содержанием гемагглютинина,использующийся при постановке реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) для определения количественного содержания гемагглютинина в полуфабрикате и готовом продукте вакцины против высокопатогенного гриппа /(51) для здравоохранения Республики Казахстан. Очищенный гемагглютинин вируса гриппа штамма //62/2009 (51) получали методом анионообменной хроматографии. Гемагглютинин выделяли из вируссодержащей суспензии рекомбинантного штамма//62/2009. Проводилась предварительная очистка вируссодержащей суспензии путем центрифугирования при 3500 об/мин. в течение 20 минут. Затем, вирус концентрировали ПЭГ-8000 в конечной концентрации 8. Сконцентрированный вирус собирали путем центрифугирования при 3500 об/мин. в течение 30 минут,осадок В результате проведенных экспериментов установлено, что наиболее оптимальным по параметрам концентрации белка,гемагглютинирующей и нейраминидазной активности является использование стартового и элюирующего буферов с рН равным 7,0. Чистоту и молекулярный вес выделенного НА рекомбинантного штамма вируса гриппа//62/2009 (51) определяли с помощью электрофореза в ПААГ-е по сравнительной подвижности с белками-маркерами. Определение размеров белков проводили с использованием программы 4.0. Результаты анализа представлены на фиг.1. В результате электрофоретического анализа НА выделенного методом ионообменной хроматографии выявлено две субъединицы НА,молекулярные массы которых составляют НА 154,791 кДа, НА 227,660 кДа. В зависимости от штамма вируса гриппа НА (молекулярная масса(м.м.)77,000 кДа) может быть протеолитически расщеплен на две полипептидные цепи - НА 1(м.м.50,000 кДа) и НА 2 (м.м.27,000 кДа), которые соединяются дисульфидными связями. Исследования полученной фракции НА методом электронной микроскопии показали, что в препарате обнаружены гомогенные структуры в виде отдельных включений и структур собранных в розетки . Результаты электронной микроскопии представлены на фиг.2. Как видно из представленных данных электронной микроскопии, в результате очистки получен НА, соединенный своими гидрофобными концами с образованием розеток. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Стандартный антиген вируса гриппа 51 реагент для количественного определения гемагглютинина в реакции одиночной радиальной иммунодиффузии, отличающийся тем, что для получения антигена используют отечественный штамм вируса гриппа А/А/62/09.