Штамм гибридных клеток 3D9B5 животных Mus Musculus L., продуцирующий моноклональные антитела к вирусу болезни Ньюкасла, предназначенный для изготовления диагностических препаратов

(51) 12 5/12 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (далее МАт) к вирусу болезни Ньюкасла. В результате слияния миеломы мыши линии 63-8-653 и спленоцитов мышей /,иммунизированных антигеном из штамма ЛаСота вируса болезни Ньюкасла, при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 и последующего клонирования методом предельных разведений получена гибродома 395, продуцирующая МАт к данному возбудителю. Специфичность полученных МАт отсутствие перекрестных реакций в ИФА с антигеном вирусов чумы плотоядных, и чумы мелких жвачных животных,а также с антигеном из неинфицированной культуры клеток. С помощью полученных МАт можно проводить специфическое выявление болезни Ньюкасла методом ИФА(непрямой варианты). Использование изобретения позволяет выявить и идентифицировать вирус болезни Ньюкасла. Выделенный штамм гибридных клеток 395 животных. депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП Научно-исследовательском институте проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан под регистрационным номером М-0310/Д.(72) Орынбаев Мухит Бармакулы Копеев Сырым Калдыбаевич Белоусов Вячеслав Юрьевич Керимбаев Аслан Амангельдиевич Савинков Александр Филлипович Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК 395 ЖИВОТНЫХ.,ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ВИРУСУ БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии, а именно к гибридомной технологии и представляет собой новый штамм гибридных клеток 395 животных Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии,а именно к гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток 395 животных., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (далее МАт) к антигену вируса болезней Ньюкасла, которые могут быть использованы в научных исследованиях и при изготовлении диагностических препаратов. Болезнь Ньюкасла высококонтагиозное вирусное заболевание, которое поражает многие виды домашних и диких птиц, в связи с чем,представляет серьезную угрозу птицеводству во многих странах мира. В настоящее время эндемичными по данному заболеванию являются такие приграничные Азиатские страны, как Китай и Россия, что представляет реальную угрозу заноса заболевания на территорию Республики Казахстан. Учитывая данный факт, разработка новых и совершенствование уже существующих средств и методов лабораторной диагностики болезни Ньюкасла, является актуальной, как с научной, так и с практической точки зрения. В настоящее время для диагностики болезни Ньюкасла разработаны и применяются такие серологические методы, как РТГА, РГА и ИФА,которые основаны на использовании как поликлональных сывороток,так и Мат. Использование поликлональных сывороток имеет ряд недостатков,связанных с подбором предварительного донора(животного),не содержащего специфических антител против наиболее распространенных и сходных по клиническим признакам инфекций, что в последние годы становится практически не возможным. Применение МАт позволяет значительно повысить специфичность и чувствительность серологических методов диагностики болезни Ньюкасла, что позволяет дифференцировать данное заболевание от схожих инфекций, а именно гриппа птиц, оспы кур, инфекционного ларинготрахеита птиц, инфекционного бронхита кур и других. Применение МАт для диагностики болезни Ньюкасла может исключить ложноположительные реакции, нередко возникающие при использовании тест-систем на основе поликлональных иммунных сывороток. Также использование МАт позволит создавать стандартизованные тест-системы за счет возможности применения антител постоянной авидности и специфичности. Аналогичные патенты 1.(133)( 100-73193)1332 3.(1 С 10)( 100-73195)1 С 102 Полученный в НИИПББ моноклональные антитела к вирусу болезни Нькасла 2 Клон 395 иммуноглобулины класса . Целью настоящего изобретения является получение гибридомы, продуцирующей МАт к вирусу болезни Ньюкасла, которые используют в серологических тестах при выявлении и идентификации данного возбудителя. Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния миеломы мыши линии 63-8653 и спленоцитов мышей/,иммунизированных антигеном из штамма Ла-Сота вируса болезни Ньюкасла, при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 и последующего клонирования методом предельных разведений получена гибродома 395, продуцирующая МКАт к данному возбудителю. С помощью полученных МАт можно проводить специфическое выявление болезни Ньюкасла методом ИФА (непрямой варианты). Использование изобретения позволяет выявить и идентифицировать вирус болезни Ньюкасла. Пример выполнения Полученный штамм гибридных клеток 395 животных., продуцирующих моноклональные антитела к вирусу болезни Ньюкасла,обладает следующими характеристиками 1. Число пассажей к моменту паспортизации составляет 10 раз. 2. Стандартные условия выращиванияКлетки культивируются в матрацах на полной ростовой среде - 1640 (с добавлением следующих компонентов 10 к объему среды фетальной сыворотки 20 мл/л 200 мМ- глютамина 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола - 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л) при 37 С, при концентрации С 2 на уровне 5 и влажности 85-90. Посевная доза 2106 клеток в 1 мл, кратность посева 12. Частота пассирования через 3-4 суток. 3. Культуральные свойства штамма Штамм является монослойно-суспензионным около 30 клеток находятся в суспензии, не прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Частота пассирования при посевной дозе 2,0105 кл см-3 составляет от 3 до 4 суток. Индекс пролиферации при выращиванииравен 7,2. 4. Характеристика культивирования в организме животного При внутрибрюшинном введении мышам/ от 2,0 106 до 5,0 106 клеток гибридомы на 921 сутки формируются серозные опухоли. От одной мыши получают от 2,0 до 3,0 см 3 иммунной асцитической жидкости(далее ИАЖ). Концентрация клеток гибридомы всоставляет от 30 106 до 50 106 кл см 3. 5. Цитогенетическая-модальный класс для родительской миеломной линии 63-8-653 - от 57 до 59 хромосом. 6. Цитоморфологическая характеристика Клон гибридомы представлен крупными округлыми клетками с размерами от 20 до 25 мкм, близкими по морфологии клеткам исходной миеломы линии 638-653. 7. Видовая принадлежность. 8. Онкогенность Гибридома при внутрибрюшинном введении вызывает серозные (в 70) случаев опухоли. 9. Контроль контаминации Грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма гибридомы отсутствует. 10. Биотехнологическая характеристика Штамм продуцирует МАт к вирусу болезни Ньюкасла-титр МАт при выращивании- 150000 (в ИФА). Характеристика продуцируемых МАт к вирусу болезни Ньюкасла- белок мишень - антиген вируса болезни Ньюкасла, фосфопротеин (Р) с молекулярной массой (ММ) 47 кДа- количество изученных пассажей-10- 3. 11. Способ криоконсервации Криоконсервация осуществляют в жидком азоте с применением криозащитной среды, состоящей из 90 фетальной сыворотки и 10 диметилсуль-фоксида . Режим замораживания суспензию клеток в криозащитной среде разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 1 см 3 (3106 кл/см 3), охлаждают до 70 С, переносят в жидкий азот. 12.Условия реактивации Ампулу с клетками штамма вынимают из жидкого азота и быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания, суспензию клеток переносят в стерильную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания должно быть не менее 60-70,которое определяется путем микроскопии клеток окрашенных 0,4 трипановым синим. Клетки гибридомы 395, выращенныев 24-луночных планшетах до конечной концентрации от 1,0106 до 1,5106 кл/см-3, осаждают с помощью низкоскоростного центрифугирования и вводят внутрибрюшин-но мышам линии/,предварительно (за 7 суток) обработанным адъювантом Пристана, в количестве от 2,0 106 до 5,0 10 клеток в объеме 0,5 см 3. На 15-21 сутки после введения гибридомы примерно у 70 животных формируются асцитные опухоли. Клетки гибридомы осаждают из ИАЖ с помощью низкоскоростного центрифугирования (1500 об.мин-1 в течение 10 минут) и используют для последующего пассажа. пернатант, содержащий МАт в высоких титрах, используют для получения диагностикума. Выделенный штамм гибридных клеток 395 животных- . депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП Научноисследовательском институте проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан под регистрационным номером М-0310/Д. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных клеток 395 животных., депонированный в коллекции микроорганизмов в РГП Научноисследовательском институте проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования, под номером М-0310/Д,предназначенный для изготовления диагностических препаратов.