Способ получения антигена для диагностики кампилобактериоза в реакции агглютинации

(51) 61 39/106 (2011.01) 12 1/20 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения антигена для диагностики кампилобактериоза в реакции агглютинации,включающий выращивание кампилобактерий на полужидкой питательной среде, накопление бактериальной массы на твердой питательной среде,смыв 0,3 формалинизированным физиологическим раствором,отмывание и суспендирование кампилобактерий в 0,3 формалинизированном физиологическом растворе, в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерийВ - 0115 КазНИВИ, который выращивают на полужидкой питательной среде, накапливают бактериальную массу на твердой питательной среде, с последующим смывом физиологическим раствором,отмывание и последующее кипячение бактериальной суспензии в течение 60 минут при 100 С и суспендирование кампилобактерий в физиологическом растворе до 1 млрд. концентрации по оптическому стандарту мутности и получают соматический антиген в качестве целевого продукта.(72) Сембина Фатима Егимбаевна Шманов Кайырбай Сагнтаевич(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Лучко М.А. Инфекционные аборты рогатого скота. М. Колос, 1972, с. 17-18(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано с целью изготовления антигена для серологической диагностики кампилобактериоза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении чувствительного кампилобактериозного антигена для постановки пробирочной реакции агглютинации при диагностике кампилобактериоза животных. 25253 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано для серологической диагностики кампилобактериоза животных. Известен способ получения цельноклеточного антигена для постановки реакции агглютинации при диагностике кампилобактериоза животных,включающий выращивание кампилобактерий на полужидкой питательной среде,накопление бактериальной массы на твердой питательной среде,смыв 0,3 формалинизированным физио-логическим раствором,отмывание и суспендирование кампилобактерий в 0,3 формалинизированном физиологическом растворе,(Лучко М.А. Инфекционные аборты рогатого скота. -М., Изд. Колос, 1972., с. 17-18). Недостатком этого способа является наличие у кампилобактерий множества термолабильных антигенов и вследствие этого невозможность межтиповой четкой дифференциации с помощью цельноклеточного типирования. Задачей изобретения является получение специфического кампилобактериозного антигена для постановки реакции агглютинации при диагностике кампилобактериоза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении чувствительного кампилобактериозного антигена для постановки пробирочной реакции агглютинации при диагностике кампилобактериоза животных. Способ получения антигена для диагностики кампилобактериоза в реакции агглютинации,включающий выращивание кампилобактерий на полужидкой питательной среде,накопление бактериальной массы на твердой питательной среде,смыв 0,3 формалинизированным физио-логическим раствором,отмывание и суспендирование кампилобактерий в 0,3 формалинизированном физиологическом растворе, в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерийВ - 0115 КазНИВИ, который выращивают на полужидкой питательной среде,накапливают бактериальную массу на твердой питательной среде, с последующим смывом физиологическим раствором,отмывание и последующее кипячение бактериаль-ной суспензии в течение 60 минут при 100 С и суспендирование кампилобактерий в физиологическом растворе до 1 млрд. концентрации по оптическому стандарту мутности и получают соматический антиген в качестве целевого продукта. В изобретении используется штамм бактерийВ - 0115 КазНИВИ,депонированнный в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт. Штамм характеризуется следующими признакам,которыми обладает культура.В - 0115 КазНИВИ. Морфологические признаки.В - 0115 КазНИВИ - изогнутая палочка в виде летящей чайки , 1-10 мкм в длину и 0,2 - 0,8 мкм в ширину. Кампилобактерий подвижные,с монотрихиально расположенными жгутиками, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. Кампилобактерий являются микроаэрофилами. Растут на полужидком агаре (ПЖА) при микроаэрофильных условиях,оптимальная температура роста 37 С, при рН среды 7,0 - 7,2. На ПЖА растут в виде диска под поверхностью агара, на твердой питательной среде мясо-пептонном печеночном агаре (ППА) в виде прозрачных сероватого цвета круглых, выпуклых колоний. При хранении культуры довольно быстро диссоциируют в шероховатые-формы. Учет характера роста необходимо проводить через 36 - 48 часов. Установив по культуральным и морфологическим признакам родовую принадлежность проводят дальнейшую типизацию для установления видовой и подвидовой типизации. Биохимические свойства. Отличительной особенностью кампилобактерий подвида фетус, в том числе и штаммаВ - 0115 КазНИВИ, является то, что они выделяют каталазу, не образуют сероводород, растут на средах с добавлением 1 глицина, 8 глюкозы, 10 желчи, не растут на средах с добавлением 3,5 хлорида, не выделяют индол, аммиак, не разжижают желатин, не свертывают молоко, переводят нитраты в нитриты. Культуры не ферментируют углеводы (глюкозу, лактозу, сахарозу,мальтозу, маннит), не растут на ПЖА при 25 С. Антигенная структура. УВ - 0115 КазНИВИ два основных антигенных комплекса О - антиген (соматический) термостабильный, Н - антиген (жгутиковый) белковой природы, термолабилен. У всех серотипов имеется общий жгутиковый белковый антиген (Н-антиген),тогда как соматические антигены специфичны для каждого подвида и подтверждают принадлежность культур к тому или иному серотипу. ШтаммВ - 0115 КазНИВИ является эпизоотическим, обладает абортогенными свойствами для суягных овцематок и высокой вирулентностью для белых мышей. За время хранения и пересевах в лабораторных условияхВ - 0115 КазНИВИ не изменил культурально морфо-логических,биохимических свойств, а также патогенность,вирулентность и антигенную структуру. Маркерные признаки штаммаВ - 0115 КазНИВИ, физиологические хемогетеротроф, является микроаэрофилом. Растет на средах с добавлением глицина. Возможна диссоциация из - в -форму, приобретение лекарственной устойчивости. Серологические при типизации с диагностическими моноспецифическими агглютинирующими кампилобактериозными сыворотками , ,типов имеет положительную реакцию с сывороткойтипа и отрицательную реакцию с сывороткамиитипов. Патогенные свойства. ШтаммВ - 0115 КазНИВИ обладает патогенными свойствами для белых мышей массой 16 -18 граммов,при подкожном введении 0,4 см 3 суточной бульонной культуры, вызывая гибель всех 10 мышей.В-0115 КазНИВИ обладает 20253 абортогенными свойствами для суягных овцематок. При подкожном введении 1-5 млрд м. т./см 3 штаммВ -0115 КазНИВИ вызывает аборты у овец. Вирулентность для белых мышей. ШтаммВ -0115 КазНИВИ обладает выраженной вирулентностью для белых мышей массой 16-18 граммов, вызывая гибель 100 животных при подкожном введении 250 тыс. м. к. в 1 см 3 в дозе 0,4 см 3 на 2 - 3 сутки. Иммунохимические - реакция агглютинации (РА) в титре - 13200. Дополнительные сведения. ШтаммВ-0115 КазНИВИ свободен от бактериальных, грибковых, микоплазменных и вирусных контаминантов. Способ получения соматического кампилобактериозного антигена состоит в следующем. Пример 1. Готовят соматический антиген путем культивирования штаммов кампилобактерий в пробирках на 0,15 полужидком мясо-пептонном печеночном агаре с добавлением 10 ферментативного гидролизина. Культуру выращивают в термостате при 37 С в эксикаторах при микроаэрофильных условиях в течение 2 суток. Затем с целью накопления бакмассы выращенную культуру переносят во флаконы с 0,15 полужидким мясопептонным печеночным агаром с добавлением 10 ферментативного гидролизина, после двухсуточного культивирования проверяют на чистоту роста и рассевают в колбы Тартаковского с 2,5 - 3,0 мясопептонным печеночным агаром. После 2-3 суточного культивирования чистый рост культуры смывают стерильным физиологическим раствором, затем кипятят бактериальную массу в течение 60 минут при 100 С и дважды промывают на центрифуге при 3000 оборотах в минуту, суспендируют в 0,9 физиологическом растворе до 1 млрд. концентрации по оптическому стандарту мутности и используют в качестве антигена. Специфичность и активность антигена проверяют в лабораторных условиях в реакции агглютинации. Пример 2. Реакцию агглютинации ставят по общепринятой методике, в пробирках в объеме 1,0 см 3. Готовят 6 рядов (по 2 ряда каждой сыворотки) последовательных разведений фабричных моноспецифических агглютинирующих кампилобактериозных сывороток , ,типов в 3 растворе хлористого натрия 150 1100 1200 1400 1800 11600 13200 16400. Затем в первые три ряда сывороток добавляют по 0,5 см 3 исследуемых соматических О-антигенов, в остальные пробирки для сравнения общепринятый цельноклеточный ОНантиген и помещают в термостат на 16-18 часов, через 3-4 часа после изъятия из термостата учитывают результаты реакции. Контролями реакции служат нормальная кроличья сыворотка с фабричным цельноклеточным антигеномтипа, кроме того,осуществляют контроль на самоагглютинацию антигенов. При этом, результаты реакции признают специфическими, если в контрольных пробирках агглютинация отсутствует. Степень агглютинации определяют в крестах. Предельным титром считают разведение сыворотки,где была отмечена агглютинация не ниже, чем на два креста. Результаты исследования цельноклеточного и соматического антигенов представлены в таблице 1. Из таблицы 1 следует, что агглютинация соматических О-антигенов отмечена в более низких титрах по сравнению с цельноклеточными ОНантигенами, что свидетельствует о специфичности соматических антигенов для каждого подвида кампилобактерий и подтверждает принадлежность культур к тому или иному типу. Использование предлагаемого способа позволит получить более чувствительный специфический антиген для диагностики кампилобактериоза в реакции агглютинации. Таблица 1 Результаты реакции агглютинации 4 Нормальная кроличья Примечание -сыворотка, -антиген, Ц-цельноклеточный, -соматический. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ-0115 КазНИВИ, который выращивают на полужидкой питательной среде,накапливают бактериальную массу на твердой питательной среде, с последующим смывом физиологическим раствором,отмывание и последующее кипячение бактериальной суспензии в течение 60 минут при 100 С и суспендирование кампилобактерий в физиологическом растворе до 1 млрд. концентрации по оптическому стандарту мутности и получают соматический антиген в качестве целевого продукта Способ получения антигена для диагностики кампилобактериоза в реакции агглютинации,включающий выращивание кампилобактерий на полужидкой питательной среде,накопление бактериальной массы на твердой питательной среде,смыв 0,3 формализированным физиологическим раствором,отмывание и суспендирование кампилобактерий в 0,3 формализированном растворе, отличающийся тем, что в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерий Верстка Нурумов У.Е. Корректор Мадеева П.А.