Способ получения антигена для диагностики сальмонеллезного аборта овец в реакции агглютинации

(51) 61 39/112 (2010.01) 61 10/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ постановки пробирочной реакции агглютинации при диагностике сальмонеллезного аборта овец. Способ получения антигена для постановки реакции агглютинации при диагностике сальмонеллезного аборта овец, включающий выращивание сальмонелл на твердой питательной среде с последующим смывом, отмывание и суспендирование сальмонелл,инактивацию полученной бактериальной суспензии нагреванием и добавление буферного разбавителя, в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерий- В - 0066 АН 9/2,который выращивают на твердой питательной среде, смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе,полученную суспензию инактивируют, после инактивации добавляют раствор 0,05 М триса и подвергают воздействию с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 50 кГц, мощности 90-100 Вт/см 2, ультразвуковых волн до просветления в течение 40 - 50 мин, затем микробный дезинтеграт центрифугируют при 20000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную жидкость сливают, консервируют фенолом до 0,5 концентрации и получают целевой продукт.(72) Калыкова Гульжан Кентаевна Сейдахметова Роза Джаровна Безрукова Анастасия Николаевна Егорова Наталья Николаевна Мусаева Асия Кыблашевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО АБОРТА ОВЕЦ В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано для изготовления антигена при серологической диагностике сальмонеллезного аборта овец. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении чувствительного сальмонеллезного антигена для 23847 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано для изготовления антигена при серологической диагностике сальмонеллезного аборта овец. Известен способ получения антигена для постановки реакции агглютинации при диагностике сальмонеллезного аборта овец, включающий выращивание сальмонелл на твердой питательной среде с последующим смывом, отмывание и суспендирование сальмонелл,инактивацию полученной бактериальной суспензии нагреванием и добавления буферного разбавителя Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. Под редакцией Б. И. Антонова./ М. Агропромиздат. - 1986.- с. 207-209. Задачей изобретения является получение основного специфического сальмонеллезного овисного соматического В - антигена для постановки реакции агглютинации при диагностике сальмонеллезного аборта овец. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении чувствительного сальмонеллезного антигена для постановки пробирочной реакции агглютинации при диагностике сальмонеллезного аборта овец. Способ получения антигена для постановки реакции агглютинации при диагностике сальмонеллезного аборта овец, включающий выращивание сальмонелл на твердой питательной среде с последующим смывом, отмывание и суспендирование сальмонелл,инактивацию полученной бактериальной суспензии нагреванием и добавление буферного разбавителя, в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерий- В - 0066 АН 9/2,который выращивают на твердой питательной среде, смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе,полученную суспензию инактивируют, после инактивации добавляют раствор 0,05 М триса и подвергают воздействию с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 50 кГц, мощности 90-100 Вт/см 2, ультразвуковых волн до просветления в течение 4 0 - 5 0 мин, затем микробный дезинтеграт центрифугируют при 20000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную жидкость сливают, консервируют фенолом до 0,5 концентрации и получают целевой продукт. В изобретении используется штамм бактерий-В - 0066 АН 9/2,депонированный в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт. Штамм характеризуется следующими признакам,которыми обладает культура(серологическая группа В). Морфологические признаки. Бактерии штамма мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами 0,8 -3 мкм в длину и 0,2-0,6 мкм в ширину, подвижные, имеют перитрихиально расположенные жгутики, спор и капсул не образуют.- являются самыми. Специализированные клетки не образуют. Культуральные свойства. На обычных средах .- растт довольно скудно, формируя мелкие (с булавочную головку) просвечивающие колонии с приподнятым центом. При посеве из патологического материала рост диффузный, едва заметный в виде нежного наложения. В затемненном поле зрения просматривается радиальная исчерченность колоний. На бульоне Хоттингера и Мартена с сывороткой крови .- растет довольно пышно, бактериальные клетки более крупные и существенно не отличаются от других сальмонелл. На бульоне образует умеренное помутнение и незначительный осадок. На полужидком агаре рост в виде кольца у поверхности среды. На агаре Хоттингера вырастают круглые, блестящие, выпуклые, влажные, чтко очерченные колонии, на проникающем свете голубоватого оттенка в- форме. Формируют на МПА мелкие компактные колонии. Накопление бакмассы наблюдают через 18-20 часов культивирования. В бульоне образуют равномерное помутнение. Аэробы или факультативные анаэробы. Оптимальная температура роста 37 С, при рН среды 7,2 - 7,4 и при комнатной температуре. Биохимические свойства. Обладает ферментативной активностью. Не продуцирует индол, не расщепляет лактозу, сахарозу, арабинозу,инозит, рамнозу, раффинозу, глицерин не разлагает. Не разжижает желатин. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, галактозу,маннозу, фруктозу, ксилозу, маннит, мальтозу,дульцит и сорбит, умеренно восстанавливает нитраты в нитриты. Сероводород, как правило, не образует или дает слабую реакцию. Патогенные свойства. Патогенность выражена слабо. При энтеральном и энтерназальном заражении овец вызвать заболевание в большинстве случаев не удается. Внутримышечное заражение приводит к гибели ягнят и переболеванию овец. Суягные овцы абортируют. Внутривенное и внутрибрюшинное заражение ягнят и овец вызывает картину острого токсикоза, септицемии и гибель животных в течение 3-7 суток. Патогенен для белых мышей. Вызывает гибель белых мышей при подкожном введении 250 тыс. м. к. Обладает абортогенными свойствами для суягных овцематок. Антигенная структура Имеет два основных антигенных комплекса О-антиген (соматический) термостабильный Н-антиген(жгутиковый) термолабильный белковой природы. Детерминантная группа О-антигена принадлежит сахарам. Серологическая специфичность и иммунологическая активность определяется полисахаридами полного антигена. При типизации с диагностическими сальмонеллезными агглютинирующими сыворотками имеет постоянную реакцию с поливалентной (А, В, С, Д,Е), О - сывороткой 1, 4, 12 и Н - сыворотками 1 -я фаза с, 2 -я фаза 1,6. Принадлежит к серологической группе В. 23847 Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы обладают дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оксидазоотрицательные каталазоположительные. Тип катаболизма - аэроб или факультативный анаэроб. Оптимальная рН - 7,2-7,4. Источники углерода глюкоза, галактоза,манноза, фруктоза, арабиноза, ксилоза, рамноза,маннит, мальтоза, дульцит и сорбит. Источники азота аминокислоты в составе питательных сред. Источники серы аминокислоты в составе питательных сред. Физиологические маркерные признаки природный ауксотроф, нуждается в метионине,цистеине, фенилаланине, треонине. Хранение на питательной среде. Культивируют на МПБ при температуре 37 С в аэробных условиях,хранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре 4-6 С в течение 36 месяцев. Способ получения сальмонеллезного антигена состоит в следующем. Пример 1. Суточную культуру-В - 0066 АН 9/2 смывают физиологическим раствором рН 7,2. В взвеси определяют концентрацию сальмонелл и готовят 100 млрд/см 3 взвесь с последующей инактивацией бакмассы на водяной бане при 80-100 С в течение 2 часов, после инактивациии бактериальной взвеси добавляют раствор 0,05 М триса и подвергают воздействию с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН - 1 при частоте 50 кГц,мощности 90-100 Вт/см 2 ультразвуковых волн до просветления в течение в течение 40 - 50 минут,затем микробный дезинтеграт центрифугируют при 20000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную жидкость сливают, консервируют фенолом до 0,5 концентрации и получают целевой продукт. Приготовленный антиген разливают в стерильных условиях во флаконы объемом 20,0 мл из нейтрального стекла, закупоривают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Специфичность сальмонеллезного антигена проверят в лабораторных условиях. Пример 2. Пробирочную реакцию агглютинации с сальмонеллезным антигеном проводят в чистых сухих стеклянных пробирках. На наружной стенке пробирки указывают номер испытуемой пробы сыворотки крови. Реакцию ставят на 0,85-ном растворев разведениях , 1 50, 1100. При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной сальмонеллезными сыворотками в разведениях 15. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах. За диагностический титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на 2 креста, что соответствует количеству международных единиц антител в 1 мл сыворотки. Контролем служат заведомо отрицательная и положительная сальмонеллезные овисные пробы сывороток крови животных. При изучении специфичности предложенного сальмонеллезного антигена для постановки реакции агглютинации при диагностике сальмонеллезного аборта овец в сравнении с биофабричным антигеном(РА) подвергают исследованию сыворотки против бруцелл, лептоспир, пастерелл, энтерококка,сальмонелла дублин, сальмонелла холерасуис,кампилобактерий (вибрио -фетус, венериалис,вибрио - фетус интестиналис, вибриобубулис). При этом во всех случаях получают отрицательный результат, что свидетельствует о специфичности приготовленного диагностикума. Специфичность и чувствительность реакции агглютинации с разработанным антигеном в сравнении с общепринятым методом (РА с биофабричным сальмонеллезным антигеном группы В) изучают таким же путем исследования 20 сывороток крови овцематок из различных по эпизоотическому состоянию ферм (хозяйств) по сальмонеллезному аборту овец. Результаты серологических исследований представлены в таблице 1. Данные о специфичности предложенного овисного сальмонеллезного антигена представлены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что при сравнительном испытании специфичности антигена в РА и РА с биофабричным сальмонеллезным антигеном с бруцеллезной,пастереллезной,хламидозной,листериозной, иерсиниозной, кампилобактериозной,сальмонеллезными суис и дублин сыворотками крови были получены отрицательные результаты, за исключением последней, что свидетельствует о высокой специфичности приготовленного сальмонеллезного антигена для диагностики сальмонеллезного аборта овец. Результаты серологических реакций при исследовании сывороток крови на сальмонеллезный аборт овец абортировавших овцематок представлены в таблице 2. Специфичность и чувствительность пробирочной реакции агглютинации с разработанным сальмонеллезным антигеном в сравнении с общепринятым методом (РА с биофабричным сальмонеллезным антигеном) изучали путем исследования сывороток крови абортировавших овцематок из различных по эпизоотической ситуации хозяйств. Как следует из таблицы 2, в благополучным по сальмонеллезному аборту овец хозяйстве, все животные имели отрицательные показания как в РА с биофабричным антигеном (пр-ва Курской биофабрики), так и в РА с разработанным сальмонеллезным антигеном. При исследовании на сальмонеллез 20 проб сывороток крови абортировавших овцематок из неблагополучных по сальмонеллезному аборту овец хозяйств получены следующие результаты в РА с биофабричным антигеном в 16 случаях получен положительный результат, в 2 случаях - положительный и в 2 случаях сомнительный в РА с разработанным 3 23847 сальмонеллезным антигеном в 18 случаях отмечался положительный результат, в 2 случаях отрицательный. Сомнительных результатов РА с разработанным антигеном не регистрировалось. При исследовании 10 проб сывороток крови суягных овцематок из благополучного по сальмонеллезному аборту овец хозяйства как в РА с биофабричным антигеном,так в РА с предложенным сальмонеллезным антигеном результаты были отрицательными. Таблица 1 Специфичность предложенного антигена для серологической диагностики сальмонеллезного аборта овец в РА Исследуемые сыворотки Результаты серологических реакций РА с испытуемым сальмонеллезным антигеном 15 110 РА с биофабричным сальмонеллезным антигеном 15 110 Иерсиниозная Кампилобактеризная Сальмонеллезная суис (группа С 1) Сальмонеллезная дублин Таблица 2 Результаты серологических реакции при исследовании сывороток крови овцематок на сальмонеллезный аборт Количество исследованных голов Сыворотки крови РА с биофабричным антигеном РА с испытуемым сальмонеллезным антигеном Пол Сом Отр ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для диагностики сальмонеллезного аборта овец в реакции агглютинации,включающий выращивание сальмонелл на твердой питательной среде с последующим смывом,отмывание и суспендирование сальмонелл,инактивацию полученной бактериальной суспензии нагреванием и добавления буферного разбавителя,отличающийся тем, что в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерий на твердой питательной среде, смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе, полученную суспензию инактивируют,после инактивации добавляют раствор 0,05 М триса и подвергают воздействию с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 50 кГц, мощности 90-100 Вт/см 2, ультразвуковых волн до просветления в течение 40 - 50 мин, затем микробный дезинтеграт центрифугируют при 20000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость сливают, консервируют фенолом до 0,5 концентрации и получают целевой продукт.