Способ получения антигена для диагностики бешенства

(51) 61 39/205 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в увеличении выхода антиген,повышении его активности и специфичности. Сущность изобретения состоит в том, что способ получения антигена для диагностики бешенства,включает интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, их убой, взятие мозговой ткани,приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, причем в качестве животных используют новорожденных ослят,мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 2530 минут, а вирус бешенства отделяют в градиенте сахарозы. Предложенная методика получения антигена для серологической диагностики бешенства позволяет повысить выход антигена, а также его активность и специфичность.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Батанова Жанат Мухаметкалиевна Икранбегийн Риза Кожаев Аскар Нурсултанович Абдикадырова Айгерим Мадиевна(56) Селимов М., Гордиенко Е. Производство антирабического иммуноглобулина животного происхождения. Методы лабораторных исследований по бешенству, Женева, ВОЗ, 1975, с. 301-303(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА(57) Изобретение относится к вирусологии,иммунологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления антигена для диагностики бешенства. 23848 Изобретение относится к вирусологии,иммунологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления антигена для диагностики бешенства. Известен, принятый за аналог, способ получения антигена для диагностики бешенства путем интрацеребрального заражения животных вирусом бешенства, их убоем, взятием мозговой ткани,приготовления суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, при этом в качестве рабического антигена, использован экстракт зараженного пастеровским штаммом фиксированного вируса бешенства мозга кролика( .,Р. Производство лечебной антирабической сыворотки на животных // Методы лабораторных исследований по бешенству / Женева ВОЗ, 1975, с. 295-300). К недостаткам известного способа относится малый выход, низкая специфичность и высокая гетерогенность антигена. Известен, принятый за прототип, способ получения антигена для диагностики бешенства путем интрацеребрального заражения животных вирусом бешенства, их убоем, взятием мозговой ткани, приготовления суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, при этом в качестве рабического антигена, использован экстракт зараженного вирусом бешенства .(штамм Москва) мозг овец (Селимов М., Гордиенко Е. Производство антирабического иммуноглобулина животного происхождения Метод, используемый в СССР // Методы лабораторных исследований по бешенству, Женева, ВОЗ, 1975, с. 301-303). К недостаткам известного способа также относится малый выход, низкая активность и специфичность антигена. Задачей изобретения является увеличение выхода антиген, повышение его активности и специфичности. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в увеличении выхода антиген,повышении его активности и специфичности. Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения антигена для диагностики бешенства,включающем интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, их убой, взятие мозговой ткани,приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, в качестве животных используют новорожденных ослят, мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут,а вирус бешенства отделяют в градиенте сахарозы. Заявленный способ отличается от прототипа тем,антиген дополнительно содержит вирусную массу,выделенную при озвучивании мозговой суспензии,очищенную в градиенте сахарозы, а в качестве продуцентов антигена используют ослят. Таким образом,заявляемый способ соответствует критерию изобретения новизна. Известное техническое решение, в котором применяется экстрагирование гомогената мозга не обеспечивает достаточного выхода антигена, что достигается в заявляемом техническом решении. Кроме того, использование озвученного гомогената мозговой ткани с выделением вируса в градиенте сахарозы усиливает активность антигена. Использование мозговой ткани новорожденных ослят (при условии, что для получения антирабической сыворотки также используются ослы) позволяет снизить гетерогенность антигена. Это позволяет сделать вывод о соответствии критерию существенные отличия. Ультразвуковой дезинтеграцией достигается разрушение клеток, что способствует более высокому выходу антигена. Выделение вируса в градиенте сахарозы позволяет достичь более высокой специфической активности антигена. Использование в качествепродуцентов антигена ослят, ткань которых гомологична животным,которых будут иммунизировать (ослы - продуценты антирабической сыворотки), позволяет. Пример получения антигена для диагностики бешенства Антиген для диагностики бешенства получают следующим образом. Для получения вируссодержащей мозговой ткани используют ослят 1,5-2 -месячного возраста,матери которых не были вакцинированы против бешенства. Животных заражают интрацеребрально в дозе 0,1-0,2 см 2 1-ной суспензией вируса бешенства (штамм ). Суспензию готовят в стерильных условиях из вируссодержащего головного мозга лабораторного животного, на котором пассируется фиксированный вирус бешенства. Ткань тщательно растирается в ступке пестиком и готовят 10 суспензию на 0,85 растворе хлорида натрия, добавляя антибиотики из расчета но 500 ЕД. пенициллина и стрептомицина на 1 мл. Далее гомогенат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, повторной подвергается обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 2530 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватно-марлевый тампон (осадок удаляется). Далее вирус бешенства очищают центрифугированием при небольшой скорости(4000 , 15 мин) для удаления крупных посторонних частиц, а затем центрифугируют при высокой скорости (40 000 , 30 мин) для осаждения вирусных частиц. Осажденный вирус ресуспендируют в физиологическом растворе (добавляют объем,равный 1/0 объема элюата), центрифугируют при 2000 в течение 10 мин для удаления крупных частиц, и надосадочную жидкость наслаивают на сахарозный градиент. 12 мл концентрированной суспензии вируса наслаивают на 28 мл линейного градиента сахарозы (1040-ный раствор сахарозы,приготовленный на физиологическом растворе,забуференном 0,01 М-фосфатным буфером с рН 7,5) и центрифугируют при 15 000 об/мин в ультрацентрифуге , ротор 25, в течение 40 2 23848 мин. Дно пробирки прокалывают и собирают фракции (по 2 мл), вытекающие из отверстия. Зона,содержащая вирус, располагается на границе верхней трети градиента. Ее легко обнаружить по опалесценции. В этой зоне должно содержаться около 65 вируса, наслоенного на градиент.(Концентрация вируса выражается в ГАЕ в 1 мл.) Вирус содержится также в более низких частях градиента, а кроме того, в осадке однако эти две фракции отбрасывают. Главную содержащую вирус фракцию разбавляют физиологическим раствором и центрифугируют при 40 000 в течение 2 ч. Осажденный вирус представляет собой более или менее прозрачную, окрашенную в соломенный цвет массу. Его ресуспендируют в физиологическом растворе, содержащем 0,08 азида натрия. Полученную белую сильно опалесцирующую суспензию хранят при 4 С. Подтверждение достижения положительного эффекта. В результате проведенных исследований установлено, что предложенная методика получения антигена для серологической диагностики бешенства позволяет более чем в 2 раза повысить выход антигена. Использование полученного антигена для иммунизации ослов-продуцентов при получении антирабической сыворотки позволило получать сыворотку с более высокой активностью (титр по РДП 164-1128), специфичностью, при этом полученная сыворотка не давала перекрестных реакций с тканями головного мозга различных сельскохозяйственных и лабораторных животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для диагностики бешенства,включающий интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, взятие мозговой ткани, приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости,отличающийся тем, что в качестве животных используют новорожденных ослят, мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут,а вирус бешенства отделяют в градиенте сахарозы.