Способ получения иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего

(51) 61 39/205 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Сущность изобретения состоит в том, что способ получения иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего включает интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, их убой, взятие мозговой ткани,приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, иммунизацию животных-продуцентов, взятие крови, отделение сыворотки и выделение иммуноглобулина, причем в качестве животных - доноров мозговой ткани используют новорожденных ослят, мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут,вирус бешенства отделяют в градиенте сахарозы, в качестве животных-продуцентов антирабической сыворотки используют ослов, иммунизацию которых осуществляют тремя видами антигена НАФ антиген,адъювантдепонированный и фенолизированный, а иммунизацию осуществляют комбинированием внутрикожных, подкожных и внутримышечных введений антигенов, полученную антирабическую сыворотку прогревают при температуре 56-58 С в течение 30 минут,глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом с последующим диализом,центрифугированием и лиофильным высушиванием. Способ позволяет снизить себестоимость иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего, повысить его активность и специфичность.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Батанова Жанат Мухаметкалиевна Икранбегийн Риза Кожаев Аскар Нурсултанович Абдикадырова Айгерим Мадиевна(56) Селимов М., Гордиенко Е. Производство антирабического иммуноглобулина животного происхождения. Методы лабораторных исследований по бешенству, Женева, ВОЗ, 1975, с. 301-303(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ПРЕЦИПИТИРУЮЩЕГО(57) Изобретение относится к вирусологии,иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего используемого для диагностики бешенства. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении недорогого,высокоактивного и специфического иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего. 23849 Изобретение относится к вирусологии,иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего используемого для диагностики бешенства. Известен, принятый за аналог, способ получения иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего путем интрацеребрального заражения животных вирусом бешенства, их убоем, взятием мозговой ткани,приготовления суспензии, ее экстрагированием и сбором надосадочной жидкости, иммунизацией животных-продуцентов, взятием крови, отделением сыворотки и выделением иммуноглобулина, при этом в качестве рабического антигена используют экстракт зараженного пастеровским штаммом фиксированного вируса бешенства мозга кролика, а в качестве продуцентов используют лошадей(Ваненков М.В., Десятников Б.Л. Диагностика и эпизоотология бешенства // Ветеринария. 1962, 1). К недостаткам известного способа относится дороговизна (дорогие продуценты) и низкая активность и специфичность получаемого иммуноглобулина. Известен, принятый за прототип, способ получения антирабической сыворотки путем интрацеребрального заражения животных вирусом бешенства, их убоем, взятием мозговой ткани,приготовления суспензии, ее экстрагированием и сбором надосадочной жидкости, иммунизацией животных-продуцентов, взятием крови, отделением сыворотки и выделением иммуноглобулина, при этом в качестве рабического антигена используют экстракт зараженного вирусом бешенства .(штамм Москва) мозг овец, а в качестве продуцентов используют лошадей (Селимов М.,Гордиенко Е. Производство антирабического иммуноглобулина животного происхождения Метод, используемый в СССР // Методы лабораторных исследований по бешенству, Женева,ВОЗ, 1975, с. 301-303). К недостаткам известного способа также относится дороговизна (дорогие продуценты) и низкая активность и специфичность получаемого иммуноглобулина. Задачей изобретения является разработка способа получения недорогого, высокоактивного и специфического иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении недорогого,высокоактивного и специфического иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего. Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего,включающем интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, их убой, взятие мозговой ткани, приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, иммунизацию животных-продуцентов, взятие крови, отделение сыворотки и выделение иммуноглобулина, в качестве животных - доноров мозговой ткани используют новорожденных ослят, мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут,вирус бешенства отделяют в градиенте сахарозы, в качестве животных-продуцентов антирабической сыворотки используют ослов, иммунизацию которых осуществляют тремя видами антигена НАФ - антиген, адъювантдепонированный и фенолизированный,причем иммунизацию осуществляют комбинированием внутрикожных,подкожных и внутримышечных введений антигенов, полученную антирабическую сыворотку прогревают при температуре 56-58 С в течение 30 минут,глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом с последующим диализом,центрифугированием и лиофильным высушиванием. Заявленный способ отличается от прототипа тем,что антиген дополнительно содержит вирусную массу, выделенную при озвучивании мозговой суспензии, очищенную в градиенте сахарозы, а в качестве продуцентов антигена используют ослят. В качестве продуцентов используют ослов с установлеными сроками иммунизации, дозами и местом введения антигена. Иммуноглобулин выделяют спиртовым методом с последующим диализом, центрифугированием и лиофильным высушиванием. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения новизна. Известное техническое решение, в котором применяется экстрагирование гомогената мозга не обеспечивает достаточного выхода антигена, что достигается в заявляемом техническом решении. Кроме того, использование озвученного гомогената мозговой ткани с выделением вируса в градиенте сахарозы усиливает активность антигена. Использование мозговой ткани новорожденных ослят позволяет снизить гетерогенность антигена. Использование в качестве продуцентов ослов позволяет снизить себестоимость и повысить активность и специфичность сыворотки. Отработаны режимы иммунизации ослов, дозы и место введения антигена. Отработаны параметры выделения иммуноглобулина. Это позволяет сделать вывод о соответствии критерию существенные отличия. В силу того, что предлагаемый способ предполагает использование ослов, удобных в уходе и содержании, с использованием гомологичного антиген, специфическая активность получаемого иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего значительно повышается, что повышает эффективность и результативность диагностических тестов. Пример получение иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего 23849 Иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий получают следующим образом. Для получения вируссодержащей мозговой ткани используют ослят 1,5-2 -месячного возраста,матери которых не были вакцинированы против бешенства. Животных заражают интрацеребрально в дозе 0,1-0,2 см 2 1-ной суспензией вируса бешенства (штамм овечий). Суспензию готовят в стерильных условиях из вируссодержащего головного мозга лабораторного животного, на котором пассируется фиксированный вирус бешенства. Ткань тщательно растирается в ступке пестиком и готовят 10 суспензию на 0,85 растворе хлорида натрия, добавляя антибиотики из расчета но 500 ЕД. пенициллина и стрептомицина на 1 мл. Далее гомогенат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, повторной подвергается обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Далее вирус бешенства очищают центрифугированием при небольшой скорости (4000, 15 мин) для удаления крупных посторонних частиц, а затем центрифугируют при высокой скорости (40 000 , 30 мин) для осаждения вирусных частиц. Осажденный вирус ресуспендируют в физиологическом растворе (добавляют объем,равный 1/0 объема элюата), центрифугируют при 2000 в течение 10 мин для удаления крупных частиц, и надосадочную жидкость наслаивают на сахарозный градиент. 12 мл концентрированной суспензии вируса наслаивают на 28 мл линейного градиента сахарозы (1040-ный раствор сахарозы,приготовленный на физиологическом растворе,забуференном 0,01 М-фосфатным буфером с рН 7,5) и центрифугируют при 15 00 об/мин в ультрацентрифуге , ротор 25, в течение 40 мин. Дно пробирки прокалывают и собирают фракции (по 2 мл), вытекающие из отверстия. Зона,содержащая вирус, располагается на границе верхней трети градиента. Ее легко обнаружить по опалесценции. В этой зоне должно содержаться около 65 вируса, наслоенного на градиент.(Концентрация вируса выражается в ГАЕ в 1 мл.) Вирус содержится также в более низких частях градиента, а кроме того, в осадке однако эти две фракции отбрасывают. Главную содержащую вирус фракцию разбавляют физиологическим раствором и центрифугируют при 40 000 в течение 2 ч. Осажденный вирус представляет собой более или менее прозрачную, окрашенную в соломенный цвет массу. Его ресуспендируют в физиологическом растворе, содержащем 0,08 азида натрия. Полученную белую сильно опалесцирующую суспензию хранят при 4 С. Рабический антиген для иммунизации ослов применяют в 3-х вариантах. Добавление к одной части суспензии 0.25 фенола образует фенольный антиген. Другой адъювантдепонированный антиген содержит в своем составе 0,05 сапонина, 20 гидрата окиси алюминия и 0,1 формалина. Третий - НАФ антиген - в пропорции 11 с неполным адъювантом Фрейнда. Для получения антирабической сыворотки отбирают клинически здоровых, упитанных ослов,полученных из благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям хозяйств. Как известно, активность антирабических сывороток во многом определяется контактом рабического антигена с обширной сетью нервных окончаний, что определило использование трех методов введения анетигена. Иммунизацию животных осуществляют чередованием внутрикожных, подкожных и внутримышечных инъекций рабических антигенов. Внутрикожные инъекции осуществляют 6 точек слева и справа область шеи, спины, крупа подкожные и внутримышечные - в область шеи и крупа. Первоначально осуществляют грундиммунизацию внутрикожно вводили НАФ-антиген по схеме 0,26(в 6 точек по 0,2 см 3),подкожно адъювантдепонированный антиген по схеме 2,02 (в 2 точки в область шеи по 2,0 см 3), и внутримышечно фенольный антиген по схеме 1,52 (в 2 точки в область крупа по 1,5 см 3). На 45-е сутки после грундиммунизации приступают к гипериммунизации, животных иммунизируют 4-8 кратно с интервалом 10-20 дней в зависимости от варианта антигена с соблюдением правил асептики и антисептики. Вначале вводят НАФ - антиген и адъювантдепонированный антиген соответственно в дозах 0,2 мл 10 точек и 2 мл 2 точки, инъекцию которого повторяют на 60-й (0,2 мл 15 точек и 3 мл 2 точки) и 75-й (0,2 мл 20 точек и 4 мл 2 точки) и 90-й день (0,2 мл 30 точек и 5 мл 2 точки). Фенольный антиген вводят в область крупа, слева и справа - на 52, 67, 82 и 97-й день в нарастающих дозах 2 мл 2 точки, 3 мл 2 точки, 4 мл 2 точки,5 мл 2 точки. Нарастание титра антител проверяют в пробах сыворотки крови, взятой индивидуально от каждого животного в процессе иммунизации по тестам РДП и РН. На 10 день после последней инъекции антигена(107 день от начала иммунизации) у ослов осуществляют пробное крововзятие по норме 400 см 3 на 100 кг живой массы. При достижении преципитационного титра 1321128 через 14 дней (118 день от начала иммунизации) производится следующее крововзятие по полной производственной норме(1800 см 3 на 100 кг живой массы). Вируснейтрализующая активность такой сыворотки,определяемая методом титрования на белых мышах,соответствует 1000-2000 ЕР. Сыворотка изготавливается стерильно, хранится при температуре 4-6 С в течение года, и используется для приготовления диагностических и лечебных препаратов. 23849 Преципитирующий иммуноглобулин выделяют спиртовым методом из высокоактивной, без следов гемолиза антирабической сыворотки, используя раствор 53-ного этанола. Предварительно, для освобождения от термолабильных ингибиторов,сыворотка прогревается в малообъемной стеклянной посуде (1000-3000 см 3) в водяной бане 30 минут при температуре 56-58 С. Сыворотка должна иметь рН 7,0-7,2 и это достигается добавлением 2 М ацетатного буфера рН 4,65 в количестве 2-6 мл на 1 л. Ацетатный буфер готовится смешиванием в соотношении 11 отдельно приготовленных 2 М растворов уксуснокислого натрия и ледяной уксусной кислоты. Сыворотку с установленной рН охлаждают до 0 С и одновременно охлаждают до минус 15-20 С предназначенный для осаждения раствор 53-ного спирта на дистиллированной воде. В условиях холодильной камеры при температуре 0 С к охлажденной сыворотке медленно,при постоянном перемешивании добавляют равный объем охлажденного спирта. Смесь продолжают перемешивать 30 минут, снижая температуру до минус 5 С, и оставляют на 16-18 часов для формирования осадка. Прозрачную надосадочную жидкость удаляют,выпавшие в осадок иммуноглобулины отделяют от некоторого количества надосадочной жидкости центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при температуре минус 5 С. Осадок глобулина растворяют в охлажденном до 4 С 0,15 М растворе хлорида натрия, постепенно повышая температуру до комнатной (2025 С). Концентрацию белка в растворе устанавливают в пределах 7-8. Для коррекции солевого состава и удаления незначительного количества спирта раствор иммуноглобулина диализируют против 5 М раствора хлорида натрия при четырехкратной его смене при температуре 4 С в течение 2-х суток в целлофановых мешочках. Затем глобулин осветляют от незначительной опалесценции центрифугированием при той же температуре в течение 30 минут при 4000 об/мин. Иммуноглобулин по фракционному составу состоит из гамма-глобулина, со следами бетаглобулина. Раствор иммуноглобулина доводят до 5-ной концентрации 0,15 М раствором хлористого натрия,консервируют мертиолатом 15000, исследуют на специфичность и преципитируюшую активность и подвергают лиофильной сушке. Определение преципитирующей активности и моноспецифичности антирабического глобулина. Преципитирующая активность иммуноглобулина определяется методом титрования РДП в агаровом геле. Исследуют 2-кратные разведения глобулина от 12 до 1256 с контрольным положительным антигеном (КПА), приготовленным из головного мозга щенят, павших от интрацеребрального заражения штаммом. В качестве отрицательного контроля используют антиген, аналогично приготовленный из мозга здоровых щенят. Положительная реакция отмечается во всех случаях образования линий преципитата любой интенсивности с КПА, причем исходное разведения 12 и 14 могут образовать 1-2 линии преципитации. Максимальное разведение преципитата соответствует его преципитирующему титру. Контрольный отрицательный антиген со всеми разведениями глобулина дает отрицательный результат. Иммуноглобулин, полученный этим способом имеет преципитирующую активность до разведения 164 - 1128, что делает его пригодным для практического применения в качестве ИДАП. На моноспецифичность иммуноглобулин проверяют в разведениях от 12 до 1256 РДП в агаровом геле с головным мозгом-различных не болевших бешенством животных(павших от различных вирусных и бактериальных инфекций)-осленка, жеребенка, ягненка, кролика, морской свинки, белых мышей, павших в результате интрацеребрального заражения фиксированным вирусом бешенства . Преципитирующий иммуноглобулин,полученный этим способом, обладает выраженной специфичностью, так как образует преципитат только с антигеном из мозга животных, зараженных рабическим вирусом. Достижение положительного эффекта при применении в РДП рабического диагностикума(ИДАП), полученного по данному способу,подтверждено в опытах по диагностике бешенства более чем в 50 пробах головного мозга различных сельскохозяйственных и диких животных, павших от бешенства. При этом отмечено полное совпадение результатов РДП и биопробы и отсутствие неспецифического образования преципитата. Метод РДП в агаровом геле с использованием ИДАП является экспресс методом диагностики бешенства и позволяет обнаружить рабический антиген в первичном патологическом материале в течение 24 часов в 95 и более процентах случаев,загнивание не является препятствием к использованию глобулина. Эффективность способа заключается в получении высокоактивного специфического антирабического иммуноглобулина без использования дорогостоящих животных,оборудования и реагентов и позволяющий изготовить сравнительно дешевый и эффективный диагностический препарат ИДАП. 23849 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего,включающий интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, взятие мозговой ткани, приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, иммунизацию животных-продуцентов,взятие крови, отделение сыворотки, выделением иммуноглобулина, отличающийся тем, что в качестве животных - доноров мозговой ткани используют новорожденных ослят, мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут,вирус бешенства отделяют градиенте сахарозы, в качестве животных-продуцентов антирабической сыворотки используют ослов, иммунизацию которых осуществляют тремя видами антигена НАФ - антиген, адъювантдепонированный и фенолизированный, а иммунизацию осуществляют комбинированием внутрикожных, подкожных и внутримышечных введений антигенов, полученную антирабическую сыворотку прогревают при температуре 56-58 С в течение 30 минут,глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом с диализом, центрифугированием и лиофильным высушиванием.