Способ получения иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего

(51) 61 39/205 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, иммунизацию животных-продуцентов, взятие крови, отделением сыворотки, выделением иммуноглобулина и мечением его флуорохромом, причем в качестве животных - доноров мозговой ткани используют новорожденных ослят, мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут, вирус бешенства отделяют в градиенте сахарозы, в качестве животных-продуцентов антирабической сыворотки используют ослов, иммунизацию которых осуществляют тремя видами антигена НАФ-антиген,адъювантдепонированный и фенолизированный,причем иммунизацию осуществляют комбинированием внутрикожных,подкожных и внутримышечных введений антигенов, полученную антирабическую сыворотку прогревают при температуре 56-58 С в течение 30 минут,глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом с диализом против 0,15 М раствора хлорида натрия, с последующей конъюгацией антител с изотиоцинатом флуоресцина, фильтрацией через сефадекс и лиофильным высушиванием. Способ позволяет снизить себестоимость иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего, повысить его активность и специфичность.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Батанова Жанат Мухаметкалиевна Икранбегийн Риза Кожаев Аскар Нурсултанович Абдикадырова Айгерим Мадиевна(56) Селимов М., Гордиенко Е. Производство антирабического иммуноглобулина животного происхождения. Методы лабораторных исследований по бешенству, Женева, ВОЗ, 1975, с. 301-303(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО(57) Изобретение относится к вирусологии,иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего, используемого для диагностики бешенства. Сущность изобретения состоит в том, что способ получения иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего, включает интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, их убой, взятие мозговой ткани, 23850 Изобретение относится к вирусологии,иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего, используемого для диагностики бешенства. Известен, принятый за аналог, способ получения иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего путем интрацеребрального заражения животных вирусом бешенства, их убоем, взятием мозговой ткани,приготовления суспензии, ее экстрагированием и сбором надосадочной жидкости, иммунизацией животных-продуцентов, взятием крови, отделением сыворотки, выделением иммуноглобулина и мечением его флуорохромом, при этом в качестве рабического антигена используют экстракт зараженного пастеровским штаммом фиксированного вируса бешенства мозга кролика, а в качестве продуцентов используют лошадей(Ваненков М.В., Десятников Б.Л. Диагностика и эпизоотология бешенства // Ветеринария. 1962, 1). К недостаткам известного способа относится дороговизна (дорогие продуценты) и низкая активность и специфичность получаемого флуоресцирующего иммуноглобулина. Известен, принятый за прототип, способ получения антирабической сыворотки путем интрацеребрального заражения животных вирусом бешенства, их убоем, взятием мозговой ткани,приготовления суспензии, ее экстрагированием и сбором надосадочной жидкости, иммунизацией животных-продуцентов, взятием крови, отделением сыворотки, выделением иммуноглобулина и мечением его флуорохромом, при этом в качестве рабического антигена используют экстракт зараженного вирусом бешенства .(штамм Москва) мозг овец, а в качестве продуцентов используют лошадей (Селимов М., Гордиенко Е. Производство антирабического иммуноглобулина животного происхождения Метод, используемый в СССР // Методы лабораторных исследований по бешенству, Женева, ВОЗ, 1975, с. 301-303). К недостаткам известного способа также относится дороговизна (дорогие продуценты) и низкая активность и специфичность получаемого флуоресцирующего иммуноглобулина. Задачей изобретения является разработка способа получения недорогого, высокоактивного и специфического иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении недорогого,высокоактивного и специфического иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего. Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего,включающем интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, их убой, взятие мозговой ткани,приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, иммунизацию животных-продуцентов, взятие крови, отделением сыворотки, выделением иммуноглобулина и мечением его флуорохромом, в качестве животных доноров мозговой ткани используют новорожденных ослят, мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут, вирус бешенства отделяют в градиенте сахарозы, в качестве животных-продуцентов антирабической сыворотки используют ослов, иммунизацию которых осуществляют тремя видами антигена НАФ - антиген, адьювантдепонированный и фенолизированный,причем иммунизацию осуществляют комбинированием внутрикожных,подкожных и внутримышечных введений антигенов, полученную антирабическую сыворотку прогревают при температуре 56-58 С в течение 30 минут,глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом с диализом против 0,15 М раствора хлорида натрия, с последующей конъюгацией антител с изотиоцинатом флуоресцина, фильтрацией через сефадекс и лиофильным высушиванием. Заявленный способ отличается от прототипа тем,что антиген дополнительно содержит вирусную массу, выделенную при озвучивании мозговой суспензии, очищенную в градиенте сахарозы, а в качестве продуцентов антигена используют ослят. В качестве продуцентов используют ослов с установлеными сроками иммунизации, дозами и местом введения антигена. Иммуноглобулин выделяют спиртовым методом с последующим диализом против 0,15 М раствора хлорида натрия, с последующей конъюгацией антител с изотиоцинатом флуоресцина, фильтрацией через сефадекс и лиофильным высушиванием. Таким образом,заявляемый способ соответствует критерию изобретения новизна. Известное техническое решение, в котором применяется экстрагирование гомогената мозга не обеспечивает достаточного выхода антигена, что достигается в заявляемом техническом решении. Кроме того, использование озвученного гомогената мозговой ткани с выделением вируса в градиенте сахарозы усиливает активность антигена. Использование мозговой ткани новорожденных ослят позволяет снизить гетерогенность антигена. Использование в качестве продуцентов ослов позволяет снизить себестоимость и повысить активность и специфичность сыворотки. Отработаны режимы иммунизации ослов, дозы и место введения антигена. Отработаны параметры выделения иммуноглобулина и конъюгации антител с изотиоцинатом флуоресцина. Это позволяет сделать вывод о соответствии критерию существенные отличия. В силу того, что предлагаемый способ предполагает использование ослов, удобных в уходе и содержании, с использованием гомологичного антигена, специфическая активность получаемого 2 23850 иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего значительно повышается, что повышает эффективность и результативность диагностических тестов. Пример получение иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего Иммуноглобулин диагностический антирабический флуоресцирующий получают следующим образом. Для получения вируссодержащей мозговой ткани используют ослят 1,5-2 -месячного возраста,матери которых не были вакцинированы против бешенства. Животных заражают интрацеребрально в дозе 0,1-0,2 см 2 1-ной суспензией вируса бешенства (штамм ). Суспензию готовят в стерильных условиях из вируссодержащего головного мозга лабораторного животного, на котором пассируется фиксированный вирус бешенства. Ткань тщательно растирается в ступке пестиком и готовят 10 суспензию на 0,85 растворе хлорида натрия, добавляя антибиотики из расчета по 500 ЕД. пенициллина и стрептомицина на 1 мл. Далее гомогенат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, подвергается повторной обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Далее вирус бешенства очищают центрифугированием при небольшой скорости(4000 , 15 мин) для удаления крупных посторонних частиц, а затем центрифугируют при высокой скорости (40 000 , 30 мин) для осаждения вирусных частиц. Осажденный вирус ресуспендируют в физиологическом растворе (добавляют объем,равный 1/10 объема элюата), центрифугируют при 2000 в течение 10 мин для удаления крупных частиц, и надосадочную жидкость наслаивают на сахарозный градиент. 12 мл концентрированной суспензии вируса наслаивают на 28 мл линейного градиента сахарозы (1040-ный раствор сахарозы,приготовленный на физиологическом растворе,забуференном 0,01 М-фосфатным буфером с рН 7,5) и центрифугируют при 15 000 об/мин в ультрацентрифуге , ротор 25, в течение 40 мин. Дно пробирки прокалывают и собирают фракции (по 2 мл), вытекающие из отверстия. Зона,содержащая вирус, располагается на границе верхней трети градиента. Ее легко обнаружить по опалесценции. В этой зоне должно содержаться около 65 вируса, наслоенного на градиент.(Концентрация вируса выражается в ГАЕ в 1 мл.) Вирус содержится также в более низких частях градиента, а кроме того, в осадке однако эти две фракции отбрасывают. Главную содержащую вирус фракцию разбавляют физиологическим раствором и центрифугируют при 40 000 в течение 2 ч. Осажденный вирус представляет собой более или менее прозрачную, окрашенную в соломенный цвет массу. Его ресуспендируют в физиологическом растворе, содержащем 0,08 азида натрия. Полученную белую сильно опалесцирующую суспензию хранят при 4 С. Рабический антиген для иммунизации ослов применяют в 3-х вариантах. Добавление к одной части суспензии 0,25 фенола образует фенольный антиген. Другой адъювантдепонированный антиген содержит в своем составе 0,05 сапонина, 20 гидрата окиси алюминия и 0,1 формалина. Третий - НАФ антиген - в пропорции 11 с неполным адъювантом Фрейнда. Для получения антирабической сыворотки отбирают клинически здоровых, упитанных ослов,полученных из благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям хозяйств. Как известно, активность антирабических сывороток во многом определяется контактом рабического антигена с обширной сетью нервных окончаний, что определило использование трех методов введения анетигена. Иммунизацию животных осуществляют чередованием внутрикожных, подкожных и внутримышечных инъекций рабических антигенов. Внутрикожные инъекции осуществляют 6 точек слева и справа область шеи, спины, крупа подкожные и внутримышечные - в область шеи и крупа. Первоначально осуществляют грундиммунизацию внутрикожно вводили НАФ-антиген по схеме 0,26(в 6 точек по 0,2 см 3),подкожно адьювантдепонированный антиген по схеме 2,02 (в 2 точки в область шеи по 2,0 см 3), и внутримышечно фенольный антиген по схеме 1,52 (в 2 точки в область крупа по 1,5 см 3). На 45-е сутки после грундиммунизации приступают к гипериммунизации, животных иммунизируют 4-8 кратно с интервалом 10-20 дней в зависимости от варианта антигена с соблюдением правил асептики и антисептики. Вначале вводят НАФ-антиген и адьювантдепонированный антиген соответственно в дозах 0,2 мл 10 точек и 2 мл 2 точки, инъекцию которого повторяют на 60-й (0,2 мл 15 точек и 3 мл 2 точки) и 75-й (0,2 мл 20 точек и 4 мл 2 точки) и 90-й день (0,2 мл 30 точек и 5 мл 2 точки). Фенольный антиген вводят в область крупа, слева и справа - на 52, 67, 82 и 97-й день в нарастающих дозах 2 мл 2 точки, 3 мл 2 точки, 4 мл 2 точки,5 мл 2 точки. Нарастание титра антител проверяют в пробах сыворотки крови, взятой индивидуально от каждого животного в процессе иммунизации по тестам РДП и РН. На 10 день после последней инъекции антигена(107 день от начала иммунизации) у ослов осуществляют пробное крововзятие по норме 400 см 3 на 100 кг живой массы. При достижении преципитационного титра 1321128 через 14 дней (118 день от начала иммунизации) производится следующее крововзятие по полной производственной норме(1800 см 3 на 100 кг живой массы). Вируснейтрализующая активность такой сыворотки, 3 23850 определяемая методом титрования на белых мышах,соответствует 1000-2000 ЕР. Сыворотка изготавливается стерильно, хранится при температуре 4-6 С в течение года, и используется для приготовления диагностических и лечебных препаратов. Флуоресцирующий иммуноглобулин выделяют спиртовым методом из высокоактивной, без следов гемолиза антирабической сыворотки, используя раствор 53-ного этанола. Предварительно, для освобождения от термолабильных ингибиторов,сыворотка прогревается в малообъемной стеклянной посуде (1000-3000 см 3) в водяной бане 30 минут при температуре 56-58 С. Сыворотка должна иметь рН 7,0-7,2 и это достигается добавлением 2 М ацетатного буфера рН 4,65 в количестве 2-6 мл на 1 л. Ацетатный буфер готовится смешиванием в соотношении 11 отдельно приготовленных 2 М растворов уксуснокислого натрия и ледяной уксусной кислоты. Сыворотку с установленной рН охлаждают до 0 С и одновременно охлаждают до минус 15-20 С предназначенный для осаждения раствор 53-ного спирта на дистиллированной воде. В условиях холодильной камеры при температуре 0 С к охлажденной сыворотке медленно,при постоянном перемешивании добавляют равный объем охлажденного спирта. Смесь продолжают перемешивать 30 минут, снижая температуру до минус 5 С, и оставляют на 16-18 часов для формирования осадка. Прозрачную надосадочную жидкость удаляют,выпавшие в осадок иммуноглобулины отделяют от некоторого количества надосадочной жидкости центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при температуре минус 5 С. Осадок глобулина растворяют в охлажденном до 4 С 0,15 М растворе хлорида натрия, постепенно повышая температуру до комнатной (2025 С). Концентрацию белка в растворе устанавливают в пределах 7-8 . Для коррекции солевого состава и удаления незначительного количества спирта раствор иммуноглобулина диализируют против 5 М раствора хлорида натрия при четырехкратной его смене при температуре 4 С в течение 2-х суток в целлофановых мешочках. Затем глобулин осветляют от незначительной опалесценции центрифугированием при той же температуре в течение 30 минут при 4000 об/мин. Иммуноглобулин по фракционному составу состоит из гамма-глобулина, со следами бетаглобулина. Для конъюгации(метки) антител предпочтительнее применять не нативные сыворотки,а их глобулиновые фракции. Необходимое количество флуорохрома для конъюгации расчитывают по концентрации в препарате белка (0,5-5 мг флуорохрома на 100 мг белка). В качестве флуорохрома используют изотиоционат флуоресцина (ФИТЦ), максимально поглощающий фиолетово-синие лучи и дающий ярко-зеленую флуоресценцию. Для проведения конъюгации фракцию глобулина доводят с помощью 0,01 М забуференного раствора поваренной соли до содержания белка, равного 1,а с помощью 0,5 М карбонатного буфера доводят рН до 9,0. Суспензию охлаждают до 4 С и очень медленно прибавляют к ней при постоянном перемешивании красящее вещество. ФИТЦ применяют в количестве 7,5 мг красителя на 10 мл 1-ного белка. После добавления красителя смесь следует оставить на несколько часов (18-22 ч) при температуре 4 С для достижения полной конъюгации. Для удаления неспецифических флуоресцирующих компонентов осуществляют фильтрацию через сефодекс- 25. Сефодекс кладут в колонку и промывают его 0,01 М забуференным раствором поваренной соли. Предварительно отцентрифугированный конъюгат осторожно помещают на сефодекс и заливают соответствующим количеством 0,01 М забуференного раствора поваренной соли. Очищенный конъюгат собирают в соответствующий сосуд. Раствор флуоресцирующего иммуноглобулина доводят до 5-ной концентрации 0,15 М раствором хлористого натрия, консервируют мертиолатом 15000,исследуют на специфичность и флуоресцирующую активность и подвергают лиофильной сушке. Флуорисцирующая активность иммуноглобулина определяется прямым методом иммунолюминесцентной микроскопии (ПМИМ). При диагностике бешенства отпечатки готовят из свежего или свежемороженного материала аммонова рога, коры полушарий, мозжечка и др.,используя при этом тщательно обезжиренные эфиром или спирт-эфиром предметные стекла(лучше специальные для люминесцентной микроскопии, толщиной 1,5 мм). Отпечатки должны быть тонкими, разнослойными. Это достигается тем,что с кусочка ткани, легко прикрепляющегося к фильтровальной бумаге или тонкой деревянной досточке-шпателю, делают 1-2 грубых отпечатка на отдельном стекле (они не используются в работе). Далее, с этой же поверхности кусочков делают отпечатки на отдельные предметные стекла,используемые для люминесцентной микроскопии. С каждого исследуемого кусочка мозговой ткани необходимо сделать не менее 4 отпечатка на 2 стекла. Для контроля аналогично приготавливают препараты из мозга здоровых животных (можно использовать для этого мозг всяких животных, не болевших рабической инфекцией). Препараты после высушивания на воздухе в течение 3-5 минут фиксируют в ацетоне при 12 С в течение 4 часов а при работе с уличным вирусом бешенства, и 10 минут - при работе с вакцинным вирусом-фикс. По мере надобности вскрывают ампулу с ДАФИ,ее содержимое растворяют в 1 мл дистиллированной 4 23850 воды (основное разведение, рН 7,2-7,4), а затем постепенно добавляя физиологический раствор хлорида натрия, или фосфатнобуферный раствор(рН 7,2-7,4),доводят общий объем иммуноглобулина до объема, создающего рабочее разведение. Рабочее разведение ДАФИ не должно содержать даже мельчайших количеств визуально видимого осадка или хлопьев препарата. Рабочее разведение ДАФИ годно к применению в течение 2 х недель после приготовления, при условии хранения в темном месте при температуре 4 С(2) в хорошо укупоренной склянке и при условии сохранения исходной полной его растворенности. На фиксированные в ацетоне препаратыотпечатки наносят каплями приготовленный в рабочем разведении ДАФИ, покрывая им весь препарат (отпечаток). Затем препараты (предметные стекла) помещают во влажную камеру, например,чашку Петри или закрытый эмалированный лоток,обычный стерилизатор, с увлажненным дном и тампонами влажной ваты и выдерживают 20-30 минут при температуре от 25 до 37 С, затем в течение 1 часа отмывают в 2 сменах 0,01 М фосфатно-буферного раствора(рН 7,2-7,4),осторожно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. После такой подготовки препараты-отпечатки вполне готовы для исследования. Примечание Указанное на этикетке рабочее разведение ДАФИ установлено на день выпуска препарата и определяется по мере хранения через каждые 3 месяца или при возникающей в этом надобности в связи с возможностью снижения препаратом активности. Рабочее разведение указывает, во сколько раз надлежит развести 1 мл основного разведения ДАФИ, чтобы его раствор был годен к использованию в работе. Указанное на этикетке рабочее разведение в 2-3 раза более концентрированное, в сравнении с красящим титром. Красящий титр- максимальное разведение исходного разведения ДАФИ,сообщающее рабическому антигену в препаратах отпечатках,специфическое свечение интенсивностью в 3-4 креста. При установлении красящего титра раствора ДАФИ препараты-отпечатки из мозга животных(кроликов, морских свинок, белых мышей), павших от фиксированного вируса бешенства, красят в течение 30 минут при 37 С. Микроскопия проводится с помощью люминесцентного микроскопа любого типа-МЛ-1,МЛ-2, МЛ-4 и др. с возбуждающими фильтрами ЖС-18 ЖЗС-19. Препараты просматривают под иммерсией. При этом используют нелюминесцирующее масло. Учитывают результаты визуально на основе оценки интенсивности свечения и морфологических особенностей светящегося комплекса антиген-антитело. Обычно наблюдают следующую картину непораженная вирусом бешенства свежая незагнившая мозговая нервная ткань (свободная от рабического антигена) светится тусклым серовато желтым или слегка зеленоватым цветом интенсивно светящихся желто-зеленых гранул и песчинок нет. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдаются разной величины и формы гранулы (в нейронах и вне клеток), которые желтозеленые интенсивно светятся. Их величина колеблется от едва заметных в виде песчинок образований до 15 -20 микронов. Чаще отмечается обилие очень мелких песок ярко желто-зеленых частиц, размером до 1 микрона, реже выявляются более крупные гранулы-до 4 микронов округлой и овальной формы и еще более крупные (6-15 микронов) округлые или овальные включения. Интенсивность свечения оценивают в крестах 4 - яркая, светящаяся желто-зеленая люминесценция гранул и мельчайших точекпесчинок 3 - отчетливо выраженная достаточно яркая желто-зеленая люминесценция гранул и мельчайших точек 2 - неяркая люминесценция желтого цвета 1- слабая люминесценция, обнаруживаемая только в крупных включениях, желто-серого цвета- - отсутствие специфической люминесценции. Диагноз на бешенство считается установленным,если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживается достаточное количество (не менее 10) типичных гранул (мелких, средних или крупных) или - скоплений групп мельчайших точек(песок) в нервных клетках или вне их, с ярким желто-зеленым свечением, при условии отсутствия в контроле подобных светящихся гранул. При отрицательном диагнозе на бешенство,устанавливаемом методом иммунолюминесцентной микроскопии, ставят биопробу на молодых белых мышах, согласно существующих наставлений, мозг от погибших мышей исследуют методами иммунолюминесцентной микроскопии или РП в агаровом геле. Достижение положительного эффекта при диагностике бешенства прямым методом иммунолюминисцентной микроскопии с применением антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина, полученного по предлагаемой методике, подтверждена более чем в 100 исследованиях препаратов головного мозга лабораторных, сельскохозяйственных и диких животных. При этом была установлена высокая диагностическая активность ИДАФ,превышающая активность аналогичного коммерческого препарата. Метод прямой иммунолюминисцентной микроскопии с использованием ИДАФ обладает высокой диагностической чувствительностью и моноспецифичностью,позволяет выявлять минимальные количества рабического антигена,независимо от того, что связан он с живым или вполне инактивированным вирусом бешенства. Эффективность способа заключается в получении высокоактивного,специфичного флуоресцирующего антирабического иммуноглобулина без использования Способ получения иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего,включающий интрацеребральное заражение животных вирусом бешенства, взятие мозговой ткани, приготовление суспензии, ее экстрагирование и сбор надосадочной жидкости, иммунизацию животных-продуцентов,взятие крови, отделением сыворотки, выделением иммуноглобулина и мечением его флуорохромом,отличающйся тем, что в качестве животных доноров мозговой ткани используют новорожденных ослят, мозговую суспензию дополнительно обрабатывают дважды ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут, вирус бешенства отделяют в градиенте сахарозы, в качестве животных-продуцентов антирабической сыворотки используют ослов, иммунизацию которых осуществляют тремя видами антигена НАФ - антиген, адъювантдепонированный и фенолизированный,причем иммунизацию осуществляют комбинированием внутрикожных,подкожных и внутримышечных введений антигенов, полученную антирабическую сыворотку прогревают при температуре 56-58 С в течение 30 минут,глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом с диализом против 0,15 М раствора хлорида натрия, с последующей конъюгацией антител с изотиоцинатом флуоресцина, фильтрацией через сефадекс и лиофильным высушиванием.