Ассоциированная живая сухая вакцина против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы животных

(51) 61 39/295 (2010.01) 61 39/07 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ содержащей в единице прививного объема трех видов иммунизирующих агентов. Ассоциированная живая сухая вакцина против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы животных,содержащая аттенуированный вакцинный вирус оспы овец, слабовирулентную культуру сибирской язвы и стабилизатор, она дополнительно содержит вакцинный штамм вируса оспы коз, а в качестве стабилизатора смесь пептона, сахарозы и желатина при следующем соотношении компонентов, мас. биомасса штамма КазНИВИ вируса оспы овец (цитопатическая активность вируса не менее 105,5 ТЦД 50 см 3) 14-16 биомасса штамма ГК-35 вируса оспы коз (цитопатическая активность вируса не менее 105,5 ТЦД 50 см 3) 14-16 биомасса штамма СТИ-1 споровой культуры сибирской язвы(72) Кутумбетов Леспек Бекболатович Кульбаева Камила Рустемовна Горелов Юрий Михайлович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Лихачев Н.В., Колосов С.Г., Борисович И.Н. Ассоциированная вакцинация овец против сибирской язвы и оспы / Труды ГНКИ. М. 1967, том 14, с.35-45(54) АССОЦИИРОВАННАЯ ЖИВАЯ СУХАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ОСПЫ ОВЕЦ, ОСПЫ КОЗ И СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и бактериологии и может быть использовано для специфической профилактики оспы овец, оспы коз и сибирской язвы среди животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении вакцины, 23851 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и бактериологии и может быть использовано для специфической профилактики оспы овец, оспы коз и сибирской язвы среди животных. Известна ассоциированная живая сухая вакцина против оспы овец и сибирской язвы, содержащая аттенуированный вакцинный вирус оспы овец,слабовирулентную культуру сибирской язвы и стабилизатор Лихачев Н.В., Колосов С.Г.,Борисович И.Н, Ассоциированная вакцинация овец против сибирской язвы и оспы /Труды ГНКИ.М.,1967.- Том 14.- с.35-45. Задачей изобретения является повышение противоэпизоотической эффективности специфических средств путем создания поливалентной вакцины, способной обеспечить невосприимчивость одновременно против трех возбудителей со снижением трудозатрат на вакцинацию и сокращению сроков формирования иммунитета. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении вакцины,содержащей в единице прививного объема трех видов иммунизирующих агентов. Ассоциированная живая сухая вакцина против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы животных,содержащая аттенуированный вакцинный вирус оспы овец, слабовирулентную культуру сибирской язвы и стабилизатор, она дополнительно содержит вакцинный штамм вируса оспы коз, а в качестве стабилизатора смесь пептона, сахарозы и желатина при следующем соотношении компонентов, мас. биомасса штамма КазНИВИ вируса оспы овец (цитопатическая активность вируса не менее 10 5,5 ТЦД 50 см 3) 14-16 биомасса штамма ГК-35 вируса оспы коз (цитопатическая активность вируса не менее 10 5,5 ТЦД 50 см 3) 14-16 биомасса штамма СТИ-1 споровой культуры сибирской язвы(2,5 10 10 живых м.т./ см 3) 14-16 пептон 14-16 сахароза 14-16 желатин остальное Штамм КазНИВИ вируса оспы овец характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм КазНИВИ 0086 (КазНИВИ) вируса оспы овец не патогенен по отношению к естественно восприимчивым животным и обладает высокой репродуктивностью в культуре клеток ПЯ, ТЯ, ТЯ-КК, ПО,-91,которые способствуют накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема культуральной суспензии. Высокие концентрации вируса в культуральной суспензии обуславливают возможность получения из нее вакцинного препарата с высокими иммунобиологическими параметрами и повышенным содержанием иммунизирующих единиц в заданном объема. Состав среды и условия культивирования для получения монослойной культуры клеток ПЯ, ТЯ,ТЯ-КК, ПО,-91 используют ростовую среду содержащую 90 среды ИГЛА-и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, для культивирования вируса на этой культуре клеток в составе данной среды уменьшают концентрацию сыворотки крови до 5. Культивирование культуры клеток и вируса в ней осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус оспы овец относится к семейству, роду, вирионы вируса имеют 6-гранную оболочку,размер вирионов вируса в пределах от 300270-200 нм. Штамм КазНИВИ-0086 (КазНИВИ) вируса оспы овец обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя оспы овец,рода, семейства. Культуральные свойства. Штамм КазНИВИ-0086 (КазНИВИ) вируса оспы овец репродуцируется и накапливается в культуре клеток ПЯ,ТЯ, ТЯ-КК, ПО,-91 в титре 105,5 -106,0 ТЦД 50/см 3(титр цитопатических доз, вызывающих клеточные поражения в монослое клеток у 50 инфицированной культуры, выращенной в сосудах, флаконах, пробирках). В указанных титрах штамм КазНИВИ-0086(КазНИВИ) в культуре клеток накапливается после двукратного последовательного пассирования в указанных биологических моделях и при использовании множественности заражения вирусом равной 0,1-0,01 ТЦД 50/кл. Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных клеток проявляется через 7296 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади в период между 120-144 ч. Антигенные свойства. Штамм КазНИВИ 0086 (КазНИВИ) вируса оспы овец в организме привитых животных, восприимчивых к оспе,стимулирует образование вируснейтрализующих (в титрах 3-7 1 о 2) и преципитирующих (в титрах 2-32) антител. Патогенные свойства. Штамм КазНИВИ-0086 (КазНИВИ) вируса оспы овец не патогенный. В организме привитых подкожно или внутримышечно овец, коз и лабораторных животных(беспородные белые мыши, сирийские хомяки, морские свинки, кролики) не вызывает каких либо видимых патологических изменений. Иммуногенные свойства. Штамм КазНИВИ-0086 (КазНИВИ) вируса оспы овец,репродуцированный в культурах клеток ПЯ, ТЯ, ТЯ-КК,ПО,-91, в дозе от 1000 ТЦД 50 при подкожном введении у овец, не зависимо от их возраста, вызывает напряженный иммунитет, который формируется на 12 сутки и продолжается в течение не менее 12 месяцев. Привитые животные полностью не восприимчивы к вирулентному вирусу оспы овец. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма КазНИВИ-0086 (КазНИВИ) вируса оспы овец при культивировании в культурах клеток ПЯ, ТЯ,ТЯ-КК и-91 сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения), а в 23851 культуре клеток ПО - не менее 7 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм КазНИВИ-0086(КазНИВИ) вируса оспы овец в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 1820 С - 6 месяцев (срок наблюдения), а при минус 40 С - 12 месяцев (срок наблюдения). Вирус,лиофилизированный в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 5, сахарозу 4 и желатин 1,0, сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 24 месяцев. Штамм Г-35 вируса оспы коз характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм Г-35-0085(КазНИВИ) вируса оспы коз не патогенен по отношению к естественно восприимчивым животным и обладает высокой репродуктивностью в культуре клеток ПЯ, ТЯ, ТЯ-КК, ПО,-91,которые способствуют накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема культуральной суспензии. Высокие концентра ции вируса в культуральной с успензии обуславливают возможность получения из нее вакцинного препарата с высокими иммунобиологическими параметрами. Состав среды и условия культивирования для получения монослойной культуры клеток ПЯ, ТЯ,ТЯ-КК, ПО,-91 используют ростовую среду содержащую 90 среды ИГЛА-и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, для культивирования вируса в этой культуре клеток в составе данной среды уменьшают концентрацию сыворотки крови до 5. Культивирование культуры клеток и вируса в ней осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус оспы коз относится к семейству, роду, вирионы вируса имеют 6-гранную оболочку, размер вирионов вируса в пределах от 300270-200 нм. Штамм Г-35-0085 (КазНИВИ) вируса оспы коз обладает морфологическими признаками,свойственными для возбудителя оспы коз, рода, семейства. Культуральные свойства. Штамм Г-350085 вируса оспы коз репродуцируется и накапливается в культуре клеток ПЯ, ТЯ, ТЯ-КК,ПО,-91 в титре 105,5 -107,50 ТЦД 50/см 3 (титр цитопатических доз, вызывающих клеточные поражения в монослое клеток у 50 инфицированной культуры, выращенной в сосудах,флаконах, пробирках). В указанных титрах штамм Г-35-0085 (КазНИВИ) в культуре клеток накапливается после двукратного последовательного пассирования в указанных биологических моделях и при использовании множественности заражения вирусом равной 0,10,05 ТЦД 50/кл . Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных клеток проявляется через 72 96 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади в период между 120-144 ч. Антигенные свойства. Штамм Г-35-0085(КазНИВИ) вируса оспы коз в организме привитых животных, восприимчивых к оспе,стимулирует образование вируснейтрализующих (в титрах 3-72) и преципитирующих (в титрах 2-32) антител. Патогенные свойства. Штамм Г-35-0085(КазНИВИ) вируса оспы коз не патогенный. В организме привитых подкожно или внутримышечно овец, коз и лабораторных животных (беспородные белые мыши, сирийские хомяки, морские свинки, кролики) не вызывает каких либо видимых патологических изменений. Иммуногенные свойства. Штамм Г-35 0085(КазНИВИ) вируса оспы коз,репродуцированный в культурах клеток ПЯ, ТЯ, ТЯКК, ПО, -91, в дозе от 1000 ТЦД 50 при подкожном введении у коз, не зависимо от их возраста, вызывает напряженный иммунитет,который формируется на 12 сутки и продолжается в течение не менее 12 месяцев. Привитые животные полностью не восприимчивы к вирулентному вирусу оспы коз. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма Г-35-0085 (КазНИВИ) вируса оспы коз при культивировании в культурах клеток ПЯ, ТЯ, ТЯКК и-91 сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения), а в культуре клеток ПО - не менее 7 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохранияемость. Штамм Г-35-0085(КазНИВИ) вируса оспы коз в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при температуре минус 18-20 С - 6 месяцев (срок наблюдения), а при температуре минус 40 С -12 месяцев(срок наблюдения). Вирус,лиофилизированный в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 4, сахарозу 5 и желатин 1,0, сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 24 месяцев. Штамм СТИ-1 характеризуется следующими признаками Назначение штамма сибиреязвенный аттенуированный штамм СТИ-1 (производственный) предназначен для изготовления живых вакцинных препаратов для животных. Штамм получен путем последовательного рассева вирулентной культуры штамма Красная Нива на питательную среду со свернувшейся нормальной лошадиной сывороткой. Бескапсульный мутант СТИ-1 (Санитарнотехнический институт), наследственно утратил свойства образовывать капсулу, а следовательно,вызывать у животных заболевание и обладает иммуногенными свойствами. Морфологические признаки эталонного штамма СТИ-1 относится к отряду, семейству , к роду и подроду. Этот род объединяет около 25 аэробных или факультативных-анаэробных,дающих положительную реакцию на каталазу бактерий.крупная (от 1,0-1,3 до 3,0-10,0 мкм) грамположительная,неподвижная спорообразующая палочка. В окрашенных препаратах концы палочек, образующих цепочки,обращенные друг к другу, прямые резко обрубленные, свободные же концы слегка закруглены. При неблагоприятных условиях в каждой вегетативной клетке образуется одна спора,чаще располагающаяся центрально. Это овальные,иногда округлые образования (длина 1,2-1,5 мкм,ширина 0,8-1,0 мкм) расположенные изолированно. Культуральные свойства. Сибиреязвенная бацилла нетребовательна к питательным средам и хорошо растет на МПА, МПБ, МПЖ, ломтиках вареного картофеля, экстрактах гороха, сои, свеклы и др. Оптимальная температура роста 35-37 С, рН 7,2-7,6. При температуре ниже 12 С и выше 45 С бацилла сибирской язвы не растет. При засеве эталонного слабовирулентного сибиреязвенного штамма СТИ-1 в МПБ,содержащий 100-120 мг общего азота,наблюдается рост на дне флакона или пробирки в виде образования хлопка и ниспадающих нитей с просветлением среды. На агаре отмечается сплошной рост сибиреязвенной культуры (колонии-формы). Диаметр колоний не превышает 3-5 мм. От краев колонии отходят завитки (локаны). Биохимические свойства. Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу и мальтозу и медленно сахарозу, трегалозу, фруктозу, декстрин. Не синтезирует протеазы и не вызывают разжижение белковых субстратов. Гемолитические свойства. На кровяном агаре через 24 ч инкубирования культуры признаки гемолиза должны отсутствовать. При микроскопии в раздавленной капле и окрашенном мазке из суточной бульонной культуры штамма СТИ-1 должны просматриваться длинные нити и палочки микробов сибирской язвы. Через 4 суток роста культуры на МПА наступает спорообразование. Для изготовления сибиреязвенной вакцины СТИ 1 используют агаровую среду на основе кислотного гидролизата мяса (МКГА) или агар на основе ферментативного расщепления мяса по Хоттингеру,Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для изготовления(МКГА) на 1 кг мясного фарша добавляют 4 л воды и 240 мл концентрированной соляной кислоты с удельным весом 1,19. Смесь подвергают гидролизу в автоклаве в течение двух часов при температуре 1321 С или в течение 3-х часов при 1261 С. При этом в основном гидролизате получается от 600 до 800 мг общего азота. Основной гидролизат мяса разводят водой до содержания 100-120 мг общего (40-60 мг аминного азота, устанавливают рН-7,0-7,3 (20 едкий натр). На каждый литр добавляют 3,0 г хлористого натрия и 7 капель 12,5 фосфорной кислоты и 2,5-4,0 отмытого агар-агара, кипятят 30 минут, устанавливают рН 7,3 , при 60 С фильтруют и разливают в четверти или колбы, стерилизуют при 1201 С в течение 30 минут. Питательный агар распределяют (накатывают) по стенке сосудов. После проверки на стерильность в течение 48 часов,четверти(колбы) засевают расплодкой сибиреязвенной культуры эталонного штамма СТИ 1. Через трое суток просматривают на чистоту,типичность роста и спорообразование (не менее 70). После этого в пробку четверти (колбы) вводят по 2 мл скипидара и выдерживают 1-2 суток при температуре 34 С. Культуру с типичным ростом смывают физиологическим раствором хлорида натрия, определяют спорообразование, чистоту,концентрацию спор. Бактериальную массу ставят на 3-5 суток в холодильник и используют для приготовления жидкой или сухой вакцины СТИ-1 Тинкториальные свойства грамположительная окраска. Остаточная вирулентность При подкожном заражении белых мышей массой 18-20 г споровой культурой штамма СТИ-1 в дозе по 3 млн. спор (в объеме 0,1 мл) у мышей возникает отек (у отдельных значительный). Часть животных (4060) через 3-7 дней погибает. Морские свинки,массой 400-450 г, после введения им под кожу споровой культуры штамма СТИ-1 в дозе по 30 млн. спор (в объеме 1 мл), погибают через 5-8 дней в количестве 50-60. Кролики живой массой 2,0-2,5 кг при введении им подкожно споровой культуры в объеме 3 мл (90 млн. спор) остаются живыми. На месте введения, у отдельных животных, может быть незначительный отек. Штамм не патогенен для кроликов и слабовирулентен для морских свинок и белых мышей. Подвижность. Неподвижные палочки и цепочки. Капсулообразование. Бескапсульные бациллы. В организме животных капсул не образует. Микробиологическая чистота. В посевах сибиреязвенной культуры штамма СТИ-1 на питательных средах не должно быть роста посторонней бактериальной и грибной микрофлоры. Антигенные свойства. В теле микроба обнаружен соматический полисахаридный антиген,который обладает термоустойчивостью и серологической активностью, участвует в реакции преципитации по Асколи,не обладает иммуногенными и токсигенными свойствами. Белково-полисахоридно-нуклеиновый комплекс вызывает аллергическую перестройку организма. В организме животных вакцинные бескапсульные микроорганизмы размножаются и выделяют протективный антиген (защитный фактор), который и обуславливает, формирование напряженного иммунитета. Стабильность свойств при пассировании. Штамм СТИ-1 при пассировании на питательных средах сохраняет исходные свойства 23851 Сохраняемость. В споровом виде на 30-40 ном растворе химически чистого глицерина приготовленного на дистиллированной воде, в запаянных пипетках срок годности эталонного штамма высылаемого биопредприятиям 2 года, при его хранении при температуре от 2 до 4 С. Штамм СТИ-1 на 30-40-ном растворе глицерина сохраняет биологические свойства и может храниться годами. Срок хранения в архиве сухой лиофилизированной вакцины СТИ-1,изготовленной с защитной средой высушивания из обезжиренного молока или нормальной инактивированной сыворотки крови лошади - 4 года. Иммуногенные свойства. При подкожном введении 0,5 мл(20,0-25,0 млн. спор), через 10-14 суток формируется напряженный иммунитет продолжительностью 12 месяцев. Пример 1. Для получения ассоциированной живой сухой вакцины против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы животных в параллельных технологических циклах готовят монослойную культуру клеток из числа чувствительных к вирусам оспы овец и оспы коз (ПЯ, ТЯ, ТЯ-КК, ПО,-91) путем стационарного культивирования в 1,5 литровых матрасах или роллерного - в 3-литровых круговых сосудах, высевая трипсинизированные или диспергированные клетки в матрасы в концентрации 25050 млн. клеток/см 3 в матрасы и 600100 млн. клеток/см 3 в круговые сосуды,которые культивируют в среде ИГЛА-,содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота при температуре 37,0-38 С в течение 30-48 ч до образования рыхловато-полного монослоя,и микробиологическую твердую агаровую питательную среду Хоттингера, которую разливают в 1,5-литровые матрасы по 120 см 3 или в 3-5-литровые круговые сосуды - 0,5-1,0 дм 3, и стерилизуют ее при температуре 121 С в течение 2 ч, а затем располагают при комнатной температуре матрасы с расплавленной средой на ровную поверхность, сосуды - во вращающиеся роллерные установки до перехода агаровой среды в твердое состояние. В последующих параллельных двух технологических циклах из трех матрасы и круговые сосуды с культурой клеток без дегенеративных изм енений ра з деляют на две группы и в одн у из них вносят модифицированный штамм КазНИВИ вируса оспы овец в дозе 0,01-0,1 ТЦД 50/кл, в другую модифицированный штамм Г-35 вируса оспы коз также в дозе 0,01-0,1 ТЦД 50/кл и продолжают инкубировать их в матрасах и сосудах в течение до появления цитопатогенного действия, обычно этот срок составляет 60-72 ч для обеих вирусов. После проявления цитопатогенного действия вирусов из сосудов с зараженной культурой клеток удаляют ростовую питательную среду и вносят поддерживающую, содержащую в составе среду ИГЛА-и 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культуру клеток обеих групп с вирусами оспы овец и оспы коз, после замены питательной среды, инкубируют при той же температуре еще в течение 48-72 ч, до развития цитопатогенного действия вируса на не менее чем 80 площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вирусов культуру клеток в матрасах и сосудах подвергают замораживанию при температуре минус 40 С в течение не менее чем 6 ч. Затем содержимое матрасев и сосудов размораживают при комнатной температуре или при температуре 370,5 С при периодическом механическом встряхивании матрасев и постоянном круговом вращении сосудов. Содержимое матрасов и сосудов с каждым вирусом объединяют в отдельных емкостях. В третьем параллельном технологическом цикле в матрасы или круговые сосуды с затвердевшей питательной средой Хоттингера вносят слабовирулентную культуру сибереязвенных бактерий в объеме по 10 см 3 в матрасы и по 20-30 см 3 - сосуды с концентрацией 1010 живых микробных тел, распределяют инокулят плавными круговыми движениями по поверхности твердой питательной среды и помещают матрасы и сосуды с инокулятами в термостаты с температурой 37-38 С,где выдерживают их до 5-7 суток, контролируя рост и концентрацию сибиреязвенных бактерий. При достижении концентрации микробов до 10 14 живых микробных тел из поверхности твердой питательной среды в матрасах и сосудах смывают стерильным фосфатнобуферным раствором бактериальную массу и переносят эту массу в отдельную общую емкость. Полученную культуральную суспензию вирусов подвергают испытанию на стерильность и биологическую (цитопатогенную) активность, а бактериальную массу сибиреязвенной культуры отсутствие посторонних контаминантов, содержание спор и концентрацию живых микробных тел. Стерильность и наличие возможных контаминантов устанавливают путем высева на бактериальные среды МПА, МПБ, среды Сабуро и Китта- Тароцци, биологическую активность вирусов- титрованием в монослойной культуре одного из чувствительных к вирусам оспы овец и оспы коз вида клеток, выращенных в пенициллиновых флаконах, содержание спор и концентрацию живых микробных тел сибереязвенной культуры микроскопией и подсчетом с помощью камеры Горяева. При стерильности и наличии титра вирусов оспы овец и оспы коз не ниже 105,75 ТЦД 50/см 3 в культуральных суспензиях, отсутствии посторонних контаминантов и спор в биомассе сибиреязвенной культуры, а также концентрации их не ниже 1014 живых микробных тел, полученные культуральные суспензии вирусов оспы овец и оспы коз, а также бактериальную массу сибиреязвенной культуры и 23851 стабилизирующую среду, содержащую в своем составе 12 пептона, 16 сахарозы и 2 желатина,объединяют в равных объемных соотношениях и после тщательного перемешивания разливают по 4,0 см 3 во флаконы при постоянном перемешивании, а затем фасованную массу замораживают при температуре не выше минус 50 С и подвергают сублимационному высушиванию. Флаконы с сухой массой заполняют азотом или вакуумируют, горлышки укупоривают герметично резиновыми пробками,которые обкатывают алюминиевыми колпачками. Сухая форма вирусо-бактериальной массы в смеси с защитной средой представляет собой компактную однородную серовато белого цвета с красноватым или кремовым оттенком таблеткообразную массу,которая после стандартизационных испытаний на иммунобиологические показатели используется в качестве ассоциированного вакцинного препарата против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы. Иммунобиологические свойства ассоциированной вакцины против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы сухой живой характеризуются следующими данными. Пример 2. Ассоциированную живую сухую вакцину против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы животных применяют подкожно однократно в дозе 1,0 см 3 при следующем соотношении компонентов биомасса штамма КазНИВИ вируса оспы овец (цитопатическая активность вируса не менее 105,5 ТЦД 50 см 3) 14 биомасса штамма ГК-35 вируса оспы коз (цитопатическая активность вируса не менее 10 5,5 ТЦД 50 см 3) 14 биомасса штамма СТИ-1 споровой культуры сибирской язвы(2,5 10 10 живых м.т./см 3) 14 пептон 14 сахароза 14 желатин остальное Пример 3. Ассоциированную живую сухую вакцину против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы животных применяют подкожно однократно в дозе 1,0 см 3 при следующем соотношении компонентов биомасса штамма КазНИВИ вируса оспы овец (цитопатическая активность вируса не менее 10 5,5 ТЦД 50 см 3) 15 биомасса штамма ГК-35 вируса оспы коз (цитопатическая активность вируса не менее 10 5,5 ТЦД 50 см 3) 15 биомасса штамма СТИ-1 споровой культуры сибирской язвы(2,510 10 живых м.т./см 3) 15 пептон 15 сахароза 15 желатин остальное Пример 4. Ассоциированную живую сухую вакцину против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы животных применяют подкожно однократно в дозе 1,0 см 3 при следующем соотношении компонентов биомасса штамма КазНИВИ вируса оспы овец (цитопатическая активность вируса не менее 105,5 ТЦД 50 см 3) 16 биомасса штамма ГК-35 вируса оспы коз (цитопатическая активность вируса не менее 105,5 ТЦД 50 см 3) 16 биомасса штамма СТИ-1 споровой культуры сибирской язвы(2,510 10 живых м.т./ см 3 ) 16 пептон 16 сахароза 16 желатин остальное Стерильность по отношению к посторонним контаминантам. Стерильность вакцины испытывают согласно требованиям ГОСТ 28085. В вакцине не должны присутствовать посторонние контаминанты бактериального и грибкового характера. Безвредность. Безвредность вакцины проверяют на 4-х здоровых овцах и 4-х здоровых козах, не зависимо от пола, путем внутримышечного введения ее в дозе 5 см 3, содержащей пятикратно превышающий по титру вирусы оспы овец, оспы коз и по концентрации - бактерий слабовирулентной культуры сибирской язвы, аналогичные показатели их в иммунизирующем объеме. У вакцинированных животных в течение 10 суток после прививки не должны отмечаться какие либо патологии местного и общего характера. Реактогенность. Реактогенность вакцины проверяют на овцах и козах, используемых в испытаниях иммуногенности путем подкожного введения препарата животным в дозе 1,0 см 3 и регистрации клинической общей и местной реакции их организма в течение 14 суток. Препарат обладает слабой реактогенностью. Реакция организма на введенную вакцину проявляется у отдельных привитых животных на 3-5 сутки повышением температуры тела на 0,5-0,7 С и кратковременным угнетением, которая продолжается не более 2 сут. В месте введения препарата могут быть безболезненные уплотнения диаметром 1 -2 см. Иммуногенность. Иммуногенность вакцины испытывают на овцах, козах и морских свинках. Для этого вакцину растворяют на стерильном физиологическом растворе хлорида натрия или дистиллированной воде, разводят этими же растворителями до биологической активности 10 4 ТЦД 50/см 3 вирусов оспы овец и оспы коз и 10 12 живых микробных клеток в 1 см 3 и вводят подкожно 4-м овцам, 4-м козам и 10-ти морским свинкам. Через 14 суток в одном испытании всех привитых овец и аналогичных 4-х не привитых овец инфицируют внутрикожной инокуляцией в области подхвостовой складки вирулентным вирусом оспы овец в дозе 103 ИД 50/0,5 см 3, в другом испытании всех привитых коз и аналогичных не привитых коз инфицируют внутрикожной инокуляцией в области подхвостовой складки вирулентным вирусом оспы коз в дозе 103 ИД 50/0,5 см 3,и в третьем испытании всех привитых морских 23851 свинок и 10 аналогичных не привитых морских свинок, инфицируют вирулентной культурой бактерий сибирской язвы - второй вакциной Ценковского в дозе 1012 живых микробных тел. Вакцина считается иммуногенной, если в течение 14 суток все привитые овцы и козы, а также не менее чем 80 привитых морских свинок останутся защищенными от вирулентных вирусов оспы и культуры бактерий сибирской язвы, в то время как все не вакцинированные овцы, козы и 80 морских свинок заболевают от вирулентных возбудителей. Цитопатогенная активность (титр) вирусов оспы овец и коз. Титр вирусов оспы определяют титрованием в одной из чувствительных к данным вирусам культуре клеток,выращенных монослойно в пенициллиновых флаконах. Для этого из растворенного на физиологическом растворе вакцины готовят десятикратные разведения на рабочем растворе Хенкса и каждым разведением в дозе по 1,0 см 3 заражают культуру клеток в 4 флаконах. За зараженной культурой клеток наблюдают в течение 12 суток путем микоскопии и цитопатогенному воздействию вычисляют титр,рассчитывая по Риду и Менча. Титр вируса в сухой вакцине должен быть не ниже 105,0 ТЦД 50/см 3. Концентрация живых сибиреязвенных спор. Расплавленный и охлажденный до температуры 4550 С МПА (мясо-пептонный агар) разливают по 1520 см 3 стерильные чашки Петри и ставят их вверх дном в термостат с температурой (370,5)С на 1824 ч. Из растворенной до исходного объема вакцины на физиологическом растворе готовят разведение 125. Из полученной суспензии готовят десятикратные разведения от 10-1 до 10-6 на стерильном физиологическом растворе и из трех последних разведений вакцины (10-4, 10-5, 10-6) стерильной пипеткой делают высевы в чашки Петри с МПА. Из каждого разведения вакцины отдельной пипеткой засевают три чашки Петри,внося по 0,1 см 3 суспензии. Высевы выдерживают при температуре 370,5 С в течение 18-24 ч. По истечению указанного времени подсчитывают количество выросших колоний. Число колоний в трех чашках каждого разведения суммируют и делят на три. К полученном у среднему арифметическому числу из разведения 10-6 добавляют 7 нолей, из разведения 10-5-6 нолей, из разведения 10-4- 5 нолей. Средняя арифметическая цифра результатов трех разведений и будет соответствовать количеству живых спор сибирской язвы штамма СТИ-1 в 1 см 3 вакцины. Количество живых спор в вакцине должно составлять 20-25 млн/см 3. Массовая доля спор культуры сибирской язвы. Из растворенной вакцины готовят десятикратное разведение (10-1) на физиологическом растворе. Из этого разведения вакцины на предметных стеклах готовят раздавленную или висячую каплю и просматривают ее под микроскопом (объектив 40,окуляр 7 или 10). В каждом поле зрения отдельно подсчитывают сибиреязвенные споры и палочки. Массовая доля сибиреязвенных спор в вакцине должна быть не менее 90. Определение типичности роста и морфологии сибиреязвенной культуры штамма СТИ-1. Из растворенной вакцины делают посевы по 0,20,3 см 3 в МПБ и МПА в двух пробирках с каждой средой. Посевы инкубируют в течение 10 сут при температуре (370,5)С, ежедневно просматривают их визуально на типичность роста сибиреязвенной культуры штамма СТИ-1. Из 24-48 часовых микробных культур,выращенных в МПБ и на МПА, готовят мазки и окрашивают их по Граму. Мазки просматривают под иммерсией. В посевах ва кцины в МПБ должен быть ха ра ктерный рост сибиреязвенной культуры штамма СТИ-1, характеризующийся образованием на дне пробирки с бульоном рыхлого белого осадка, в толще среды незначительного количества хлопьев растущей культуры или нити, опускающиеся ко дну, а на поверхности пристеночного кольца. Бульон остается прозрачным или с небольшой опалесценцией. При встряхивании пробирки с посевами осадок разбивается на мелкие хлопья. Не допускается рост с образованием пленки,помутнением среды. На поверхности МПА должен быть рост в виде серовато-беловатых мелкозернистых колоний с серебристым оттенком, а в отдельных случаях-форм.В мазках, окрашенных по Граму, должны быть крупные (3-10 мкм) грамположительные палочки, которые располагаются поодиночке или соединены в цепочки. В небольшом количестве могут наблюдаться споры, представляющие собой овальные, иногда округлые образования размером 1,2-1,50,8-1,0 мкм. Капсулообразование. Из средней пробы вакцины делают посевы по 0,5 см 3 в две пробирки со средой ГКИ, а также заражают 5 белых мышей,внутрибрюшинно дозе 1,0 см 3, содержащих 30-50 млн живых спор. По истечении 18-24 ч инкубации при температуре (370,5)С из выросших в среде ГКИ микробных культур готовят мазки на предметных стеклах. Стекла подсушивают на воздухе до полного высыхания мазков, фиксируют в смеси Никифорова (одна часть этанола и одна часть эфира) в течение 15 мин. После фиксации мазки высушивают на воздухе и окрашивают синькой Леффлера или по Романовскому-Гимзе в течение 15-20 мин. Краску смывают водопроводной водой,предметные стекла с мазками высушивают фильтровальной бумагой и просматривают под иммерсионной системой микроскопа не менее 100 полей зрения каждого мазка. Все или большинство зараженных белых мышей должны погибнуть в течение 5 сут. Выживших мышей по истечению указанного срока убивают. Из брюшного эксудата, сердца и селезенки павших и убитых белых мышей делают мазки-отпечатки на предметных стеклах, фиксируют, окрашивают и микроскопируют также как и мазки из микробной культуры, выросшей на среде ГКИ. 23851 В мазках, приготовленных из микробной культуры, выращенной на среде ПГК, а также в мазках-отпечатках из брюшного эксудата, сердца и селезенки белых мышей должны быть только бескапсульные сибиреязвенные микробы. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Ассоциированная живая сухая вакцина против оспы овец, оспы коз и сибирской язвы животных,содержащая аттенуированный вакцинный вирус оспы овец, слабовирулентную культуру сибирской язвы и стабилизатор, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит вакцинный штамм вируса оспы коз, а в качестве стабилизатора смесь пептона, сахарозы и желатина при следующем соотношении компонентов, мас. биомасса штамма КазНИВИ вируса оспы овец (цитопатическая активность вируса не менее 105,5 ТЦД 50 см 3) 14-16 биомасса штамма ГК-35 вируса оспы коз (цитопатическая активность вируса не менее 105,5 ТЦД 50 см 3) 14-16 биомасса штамма СТИ-1 споровой культуры сибирской язвы