Способ выделения ДНК-полимеразы альфа из зародышей пшеницы

(51) 61 36/899 (2006.01) 12 9/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ результате, с выделением гомогенного препарата с максимально высокой удельной активностью,использованием его в качестве антигена,получением антител и проведением одностадийного иммуноаффинного выделения фермента. Поставленная задача достигается тем, что в предлагаемом способе выделения используют комбинацию различных хроматографических носителей (- и фосфоцеллюлоза) с высокой механической прочностью, позволяющей проводить хроматографию с высокой скоростью с последующим концентрированием фракций,обладающих ферментативной активностью путем осаждения сульфатом аммония, обессоливанием путем гель-фильтрации, а также проведением одностадийной иммуноаффинной очистки. В результате изменения последовательности хроматографических процедур,использовании фосфоцеллюлозы, замены диализа на гельфильтрацию,использованию полученного препарата в качестве антигена и проведения иммуноаффинной хроматографии получают гомогенный фермент с удельной активностью равной 80000 ед.акт/мг белка. Проведенный ингибиторный анализ подтверждает принадлежность полученного фермента ДНК-полимеразы к классу альфа.(72) Балмуханов Тимур Саимович Айтхожина Нагима Абеновна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ АЛЬФА ИЗ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ 57) Изобретение относится к области молекулярной биологии, основными сферами его применения являются биохимия и энзимология, в частности при выделении ферментов. Задачей изобретения является разработка способа выделения ДНК-полимеразы альфа из зародышей пшеницы с уменьшением времени очистки фермента,сокращением числа промежуточных процедур, заменой диализа на гельфильтрацию в процессе обессоливания и, в 22020 Изобретение относится к области молекулярной биологии, основными сферами его применения являются биохимия и энзимология, в частности при выделении ферментов. Репликативные и репаративные процессы тесно связаны между собой. Данные процессы и ферменты их осуществляющие, детально изучены в клетках прокариот и эукариот животного происхождения. Исследование ферментов, выполняющих данные функции у растений находится в стадии изучения и методы их выделения разработаны в значительно меньшей степени ( .,//,, 1986, .,.312-386. Краевский А.А., Куханова Б.К. ДНК полимеразы эукариот. М. Наука. 1986). Известен способ выделения ДНК-полимеразы альфа из зародышей пшеницы с удельной активностью 5900 ед/мг белка с использованием хроматографических процедур с применением метода колоночной ионообменной хроматографии на -целлюлозе и обессоливания при помощи диализа ( .,-.,.//). Недостатком описанного способа является длительность процедуры выделения (до трех суток) и, в связи с этим, низкая (5900 ед/мг белка) удельная активность полученного препарата. Задачей изобретения является разработка способа выделения ДНК-полимеразы альфа из зародышей пшеницы с уменьшением времени очистки фермента, сокращением числа промежуточных процедур, заменой диализа на гель-фильтрацию в процессе обессоливания и, в результате, с выделением гомогенного препарата с максимально высокой удельной активностью, использованием его в качестве антигена, получением антител и проведением одностадийного иммуноаффинного выделения фермента. Поставленная задача достигается тем, что в предлагаемом способе выделения используют комбинацию различных хроматографических носителей(- и фосфоцеллюлоза) с высокой механической прочностью, позволяющей проводить хроматографию с высокой скоростью с последующим концентрированием фракций, обладающих ферментативной активностью путем осаждения сульфатом аммония, обессоливанием путем гельфильтрации, а также проведением одностадийной иммуноаффинной очистки. В результате изменения последовательности хроматографических процедур,использовании фосфоцеллюлозы, замены диализа на гельфильтрацию, использованию полученного препарата в качестве антигена и проведения иммуноаффинной хроматографии получают гомогенный фермент с удельной активностью равной 80000 ед.акт/мг белка. Проведенный ингибиторный анализ подтверждает принадлежность полученного фермента ДНК-полимеразы к классу альфа. Пример 1. Пророщенные зародыши пшеницы гомогенизировали в жидком азоте, гомогенат смешивали в течение 10 мин с буфером для лизиса А (50 мМ Трис, рН 7.2, 5 мМ 2, 250 мМ сахарозы, 1 мМ фенилметилсульфонилфлюорида (ФМСФ) и центрифугировали при 5000 об/мин. Супернатант последовательно осаждали двумя концентрациями сульфата аммония 30 и 70. Осадок, полученный после осаждения 30 сульфатом аммония отбрасывали, а осадок, полученный осаждением 70 сульфатом аммония растворяли в буфере Б, содержащим 50 мМ Трис С 1, рН 7.9, 7 мМ 2-меркаптоэтанола,0.1 мМ ЭДТА-, 1 мМ ФМСФ, 20 глицерина и различные концентрации КС 1. Обессоливание проводили на колонке, содержащей Сефадекс -50. На следующей стадии полученный материал очищали путем ионообменной хроматографии с использованием смолы линейным градиентом КС 1 (50 мМ - 1 М) в буфере Б. Фракции, содержащие ДНК-полимеразу, элюируются одним пиком при ионной силе 300-400 мМ КС 1. На следующем этапе проводили обессоливание на колонке с Сефадексом -25 и наносили на колонку с фосфоцеллюлозой и разделяли с использованием градиента КС 1 (100 мМ - 1 М). Пик, содержащий максимальную полимеразную активность элюируется при молярности КС 1 около 500 мМ. Хроматографические профили очистки фермента приведены на фиг. 1. Количественное описание процесса, включающее данные измерения общей активности фракций, содержания белка и удельной активности фермента на разных стадиях очистки приводится в таблице 1. Чистота препарата продемонстрирована с использованием метода нативного электрофореза в полиакриламидном геле получена единственная полоса. Для описания субъединичного строения применяли денатурирующий-электрофорез,согласно результатам которого выделенный предлагаемым методом фермент состоит из четырех субъединиц с молекулярной массой 104, 79, 69, 25 кДа. Нативная молекулярная масса, определенная методом гельфильтрации составляет 275 кДа и эти результаты коррелируют с данными денатурирующего электрофореза. Таблица 1 Постадийное описание процесса выделения ДНК полимеразы Носитель Общая активность,Общее Удельная активность, ед. ед. акт. х 103 содержание белка, мг акт. х 10 Сульфатная фракция НО 5 040 НО Сефадекс -25 НО 4 050 НО 2 150 550 4.3 Фосфоцеллюлоза 400 38 10.5 2 22020 НО - активность не определялась На следующем этапе разработан иммуноаффинный способ выделения ДНК полимеразы альфа. Очищенный препарат фермента,полученный, согласно вышеописанному протоколу,использовали в качестве антигена для получения кроличьих поликлональных антител, применение которых в качестве лиганда, делает возможным выделение и очистку фермента в результате использования лишь одной иммуноаффинной процедуры. Гомогенизация, осаждение белка и обессоливание проводится аналогично вышеописанному протоколу. Далее препарат наносится на колонку с иммобилизованными антителами против ДНК-полимеразы альфа. Основной проблемой данного этапа исследований явился подбор оптимального элюэнта, обладающего высокой эффективностью элюции с одной стороны и не вызывающего инактивации фермента, с другой стороны. Проведен подбор оптимального элюэнта,наилучший результат получен при использовании 8 М мочевины при рН 8.2. Использование предлагаемого способа выделения фермента ДНК-полимеразы альфа обладает по сравнению с существующими способами следующими преимуществами 1. Сокращение времени выделения фермента приводит к значительной экономии рабочего времени, повышая т.о. эффективность научного процесса. 2. Получение фермента с активностью более, чем в десять раз высокой, по сравнению с ранее описанными, приводит к соотносимой, т.е. приблизительно десятикратной экономии лабораторных реактивов и расходных материалов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения ДНК-полимеразы альфа из зародышей пшеницы, включающий колоночные хроматографии на и фосфоцеллюлозе,отличающийся тем,что используют комбинацию ионообменных смол и применяют одностадийную иммуноаффинную хроматографию для получения фермента с удельной активностью равной 80 000 ед.акт/мг белка.