Способ очистки антигена ящурного штаммоспецифического типа А для серологических реакций

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ реакций включает смешивание антигена с хлороформом, при этом в качестве антигена используют антиген, полученный из производственного штамма Таласский вируса ящура типа А,инактивированного при температуре 58-60 С в течение 3-5 часов и центрифугированного при 6000 об/мин в течение 30 минут, который смешивают с 10 хлороформом в течение 5-7 минут на гомогенизаторе, обрабатывают ультразвуком интенсивностью 100 Вг/см 3 в течение 30 секунд, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут, к полученному надосадку добавляют сернокислый аммоний и осаждают при температуре 4 С в течение 20-24 часов, затем вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут, полученный осадок разводят забуференным физиологическим раствором,проверяют активность сыворотки в реакции связывания комплемента (РСК) и выявляют антиген с активностью 132 - 164. Полученный антиген вируса ящура обладает типоспецифическими и штаммоспецифическими свойствами. Комплементсвязывающая активность антигена в РСК 132 - 164. Антиген пригоден для лабораторной диагностики вируса ящура типа А в серологических реакциях РСК, РУСК, РДП.(72) Хайруллин Берик Мухитович Матвеева Валентина Михайловна Касенов Мархабат Мелисбекович Волгин Евгений Николаевич Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ АНТИГЕНА ЯЩУРНОГО ШТАММОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ТИПА А ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой новый способ получения антигена ящурного штаммоспецифического типа А для серологических реакций. Способ очистки антигена ящурного штаммоспецифического типа А для серологических 15490 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой новый способ очистки антигена ящурного штаммоспецифического типа А для серологических реакций. Известен способ получения ящурного антигена типа А для иммунохимических реакций (патент 2141116, 1999). Вирус ящура типа А, штамм 1707 Армения-98, выращивают в монослое клеток ВНК-21 или ПСГК-30. Полученный вирус подвергают концентрированию полиэтиленгликолем. Очищают хлороформом и инактивируют аминоэтилэтиленимином. При отсутствии остаточной вирулентности и активности в РСК 18 и выше антиген высушивают методом лиофилизации. Известен способ очистки и стерилизации культурального вируса ящура (патент ,2054039, 1996). В суспензию культурального вируса ящура добавляют при перемешивании 5-или 10-ный водный раствор флокулянта полигуанидина до конечной концентрации 0,005 - 0,03, рН 7,6-8,0 флокулированные балластные белки отделяют центрифугированием, сепарированием или отстоем. Известен способ стерилизующей очистки вируссодержащей суспензии (патент ,94015305, 1997). В суспензию вируса ящура,приготовленную из целых или разделанных крольчат, добавляют при перемешивании 5 или 10-ный водный раствор флокулянта полигуанидина м.м. 20000-100000 Д рН 7,4-7,8 до конечной концентрации 0,03-0,1. Через 30-60 мин в суспензию добавляют хлороформ в объеме 3-5 и смесь интенсивно перемешивают до исчезновения красной окраски последней с последующим отделением балластных примесей центрифугированием, сепарированием или отстоем. В предлагаемом способе очистки антигена ящурного штаммоспецифического типа А для серологических реакций используют штамм Таласский вируса ящура типа А на который получен патент ,9139, 2000. Также в предлагаемом способе очистки не используют некоторые химические вещества(полиэтиленгликоль, аминоэтилэгиленимин, полигуанидин), применяемые в аналогах. Задачей является разработка способа очистки антигена ящурного штамма специфического типа А,годного для использования в серологических реакциях для диагностики, дифференциальной диагностики и типизации возбудителя инфекции. Антиген получен из производственного штамма Таласский вируса ящура типа А, выращенного в организме 2-3 суточных крольчат-сосунов. Из тушек крольчат готовили 10 суспензию. Суспензию инактивировали теплом при 58-60 С в течение 3-5 часов. Предварительную очистку производили при помощи центрифугирования при 6000 об/мин в течение 30 минут. Для окончательной очистки в суспензию добавляли 10 хлороформа и перемешивали на гомогенизаторе. С целью ускорения и повышения качества очистки смесь вируссодержащей суспензии с органическим растворителем (хлороформом) подвергали эмульгированию на ультразвуковом дезинтеграторе типа 2 500 с частотой 20 кГц. На основании проведенных опытов установлены следующие параметры очистки суспензии с применением ультразвука при однократной обработке объемов до 200 мл интенсивность 100 Вт/см, время озвучивания 30 сек. Затем суспензию, обработанную хлороформом и ультразвуком, подвергали центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 минут, с целью осаждения баластных белков. Концентрацию антигена осуществляли осаждением из надосадка в течение суток высаливанием сернокислым аммонием при 4 С из расчета 27 г сернокислого аммония на 100 мл суспензии. Осадок собирали центрифугированием и ресуспендировали в забуфе-ренном физиологическом растворе до необходимого объема. Антиген характеризуется следующими свойствами. Время репродукции в организме двухтрехдневных крольчат -15-30 часов. Время репродукции в культуре клеток ВНК-21 17-18 часов. Доза заражения для двух-трехдневных крольчат не ниже 10 7,5 ЛД 50/см 3 на мышатах-сосунах. Титр инфекционности 10 вируссодержащей суспензии не ниже 10 75 ЛД 50/см 3 на мышатахсосунах или ТЦД 50/см 3 в культуре клеток. Количество общего вирусного белка в 10 вируссодержащей суспензии не ниже 1,5 мкг/мл. Количество 146 компонентов в 10 вируссодержащей суспензии не ниже 0,8 мкг/мл. Полученный антиген вируса ящура обладает типоспецифическими и штаммоспецифическими свойствами. Комплемент связывающая активность антигена в РСК 132-1 64. Антиген пригоден для лабораторной диагностики вируса ящура типа А в серологических реакциях РСК, РУСК, РДП. Пример. Маточный материал вируса ящура типа А, штамм Таласский, прошедший контроль на стерильность, наличие посторонних примесей,биологическую активность и авирулентность для мышат-сосунов, разводят в 1000 (10) раз на забуференном физиологическом растворе (рН 7,4 7,6), содержащем антибиотики. Крольчат 2-3 дневного возраста, массой не менее 60 г. заражают полученным разведением в область спины в дозе 107,5 ЛД 50)/см 3. Зараженных крольчат содержат в эмалированной посуде с гигроскопической подстилкой в термальной комнате при температуре 24-26 С. Крольчат павших в течение 15-30 часов после заражения используют для изготовления антигена, а павших до и после указанного временного промежутка бракуют и уничтожают путем автоклавирования в течение 2 часов при 0,15 мПа. Тушки крольчат размалывают на размельчителе тканей РТ-1 и готовят 10 суспензию на забуференном физиологическом растворе (рН 7,4-7,6). Суспензию инактивируют теплом при температуре 58-60 С в течение 3-5 часов. Затем суспензию центрифугируют при 6000 об/мин 30 минут, чтобы избавиться от остатков тканей. Центрифугат перемешивают с 10 15490 хлороформа в течение 5-7 минут на гомогенизаторе и обрабатывают ультразвуком интенсивностью 100 Вт/см 30 секунд. Затем снова центрифугируют при 6000 об/мин 30 минут. В надосадок добавляют сернокислый аммоний для осаждения антигена. Осаждение проводят при температуре 4 С в течение 20 -24 часов Затем суспензию центрифугируют при 6000 об/мин 30 минут и осадок разводят в забуференном физиологическом растворе. Антиген используют в серологических реакциях(РСК,РУСК,РДП) для диагностики,дифференциальной диагностики ящура и типизации возбудителя инфекции. Титры антител при использовании антигена,полученного по предлагаемой методике одинаковы и выше с показателями эталонного вируса А 22. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ включающий смешивание антигена с хлороформом,отличающийся тем, что в качестве антигена используют антиген,полученный из производственного штамма Таласский вируса ящура типа А, инактивированного при температуре 58-60 С в течение 3-5 часов и центрифугированного при 6000 об/мин в течение 30 минут, который смешивают с 10 хлороформом в течение 5-7 минут на гомогенизаторе, обрабатывают ультразвуком интенсивностью 100 Вт/см 3 в течение 30 секунд,центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут, к полученному надосадку добавляют сернокислый аммоний и осаждают при температуре 4 С в течение 20-24 часов, затем вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут, полученный осадок разводят забуференным физиологическим раствором, проверяют активность сыворотки в реакции связывания комплемента Способ очистки антигена ящурного штаммоспецифического типа а для серологических реакций, Верстка Молдахметова Д.А. Корректор Мадеева П.А.