Способ получения человеческого эритропоэтина

трех клонов имеют полную длину. Эти кДНК клонируют в вектор экспрессии. трансформируют ими клетки вируса 5/-40 обезьяны(клеточная линия СО 5-1) а также клетки яичника китайского хомячка (клеточная линия СНО). ЭПО. полученный из клеток СОЗ. является биологическими активными ЭПО Ел итго и Ел то. ЭПО, полученный из клеток СНО. также биологически активен Ел что и т уйуо. с кДНК-клон ЭПО имеет открытую рамку считывания из 14-15 аминокислот (аа) с инициатором и терминатором из 20-30 нуклеотидов (т) вверх по направлению кодирующей области. Образец Е.со 1. трансформированный клонированным геном ЭПО, депонирован в Атегйсап Туре Сшшге Сонесгйоп. Воск убПе. Магуало. под номером АТСС 40153.Основные этапы способа состоят в следующем. Выделение геномного клона человеческого ЭПО.1. Человеческий ЭПО очищают до гомогенности из мочи пациентов. страдающих апластической анемией. Полное переваривание этого очищенного ЭПО трипсином протеазы дало фрагменты. которые разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой подвергаютсеквенированию(см.табл.2 ИЗ). Две из аминокислотных последовательностей /а-Аэл-Рле-Туг-Ма-Тгр-Ьуу и /а-ТугЗег-Азп-Рле-Ьеи-Агбо. выбирают для конструирования олигонуклеотидных зондов.Олигонуклеотиды используют для скрининга человеческой геномной ДН Кбиблиотеки в векторе СЬ 4 А.Фаг. гибридизирующий к 17 мег. отбирают распределяют на малые группы и гибридизуют с 14 мег и 18 мег пулами. Фаг,гибридизирующий к 17 мег. 18 мег и 14 мег пулам. очищают от пятен. а фрагменты субклонируют в векторы М 13 для секвенирования путем дидезокси-метода. и получают два клона А -НРО И Я -НЕРО 2.2. Выделение клонов кДНК ЭПО.Моггпегп анализ сыворотки плода теленка (возраст 20 недель) печеночной мРНК осуществляют с использованием 95 п однонитиевого зонда. полученного из клона М 13,содержащего участок 87 ор экэона. описанного в табл.1. Далее мРНК ЭПО идентифицируют с использованием того же зонда для скрининга 1 -кДНК библиотеки бактериофата мРНК сыворотки плода теленка. Несколько гибридизирующих клонов получают с частотой приблизительно 1 положительный на 250000 подвергнутых скринингу ре 2876комбинантов. Полная нуклеотидная и аминокислотная последовательности для этих кпонов( Я-НЕРОР ЫЗ и А -НЕРОР 1.8) представлены в табл.5 и б.3. Структура и последовательность гена ЭПО человека. Гибридизационный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов и различных зондов позволил определить положение гена ЭПО внутри приблизительно 3.3 кб области. Полный анализ секвенирования этой области и сравнение с клонами кДНК приводят к получению карты интронной и экзонной структуры гена ЭПО. Ген ЭПО имеет 5 экзонов. Часть экзона . полные экзоны Н. Н и /. а также экзон / содержат коди рующую белок информациюд Оставшиеся части экзонов 1 и4. Неустойчивая экспрессия ЭПО в клетках СОЗ.Вектор р 9 1 О 23/В/ содержит основной поздний промотор аденовируса. последовательность полиаденелирования 5/40. /40 начало репликации. ген-усилитель /40 и ген /А аденовируса. Вставку кДНК из Я. НЕРОР ШЗ встраивают в вектор р 91 О 23 и получают рекомбинантную плазмидную ДНК рРТР ИЗ. Полученной ДНК трасфектируют штамм М 6 клеток СО 1 клетки промывают. переносят в среды, не содержащие сыворотку. клетки собирают через 48 ч. С использованием количественного радиоиммунного анализа исследуют уровень экспрессии ЭПО в культуральную надосадочную жидкость. Вектор. содержащий кДНК ЭПО из А -НЕРОР 1.13, трансфектируют в клетки СО 51. Наличие ЭПО в кул ьтуральной среде определяют с помощью Н-тримидин и СРЦ-Е методом или любым из двух анализов 1 п чйуо. а именноЭти результаты показывают. что биологически активный ЭПО продуцируется в клетках С 05-1. Было установлено. что ЭПО. продуцируемый клетками СОЗ. имеет подвижность на ЗОЗ-попиакриламидном геле. которая идентична подвижности нативного ЭПО, полученного из человеческой мочи. Различные векторы содержащие другие промоторы, также могут быть использованы в клетках СО или в других млекопитающих или эукариотических клетках. Примеры этих иных промоторов. которые могут быть использованы в заявленном способе. включают ранние и поздние промоторы /40 генный промотор металлотеоннина мыши. промотор. обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусов3 птиц или млекопитающих. полиэдральный генный промотор бакуловируса И другие Примерами штаммов - реципиентов. которые могут использоваться в заявленном способе. являются Е.соН. дрожжи клетки5 млекопитающих. такие как СНО (яичник ки тайского хомячка). С 127 (эпителий обезьяны), ЗТЗ (мышиный фибробпаст). С/-1(почка африканской зеленой мартышки) и клетки насекомых такие. как клетки от Зрооортега тгиойрегоа и ВгоэорлНа тетапооазгег. Эти промоторы и типы клеток могут обеспечить возможность регулирования уровня экспрессии ЭПО.Вирус ядерного полиэдроза имеет геном двунитевой кольцевой ДНК размером 128 кб. Нуклеокапсид вируса имеет палочковидную форму и находится упакованным в двух формах. Эти вирусы могут быть обычным путем размножены в культуре клеток насекомых. Среды для культивирования этих клеток это обычно питательный солевой раствор и 1 О-я фетальная телячья сыворотка. п уйтго. вирусный рост инициируется. когда неокклюдированный вирус (НОВ) входит в клетку и продвигается к ядру, где он реплицируется. Репликация является ядерной. В течение начальной фазы (818 ч постинфекции) вирусной аппликации нуклеокапсиды собираются в ядре и впоследствии проходят через плазменнуюмембрану распространяя инфекцию покультуре клеток. Кроме того. некоторые нуклеокапсиды впоследствии (еще 18 ч постинфекции) остаются в ядре и закупориваются в белковой матрице. известной как полиэдральное внутриклеточное включение (ПВВ). Эта форма не является инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка,известного как полиэдрин. молекулярный вес 33 кд. Каждое ПВВ имеет приблизительно 1 мм в диаметре и в ядре могут быть до 100 ПВВ. Ясно. что большое количество полиэдрина продуцируется позже в цикле заражения и оно составляет до 25 общего количества клеточного белка.Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации т что, полиэдриновый ген может быть убран из вирусной хромосомы без КаКСГО бы ТО НИ бЫЛО ВЛИЯНИЯ на ЖИЗНЕСПОсобность дл уйтго. При использовании вируса в качестве вектора экспрессии заменяют область. кодируюшую полиэдриновый ген. чужеродной ДНК и помещают ее под контроль полиздринового промотора. Это приводит к вирусному фенотипу. не образующему ПВВ.Описаны рекомбинантные плазмидные ДНК. содержащие ген ЭПО под контролем промотора вируса ядерного полиадроза.В результате генетической рекомбинации происходит заглещение области полиэдринового гена АзМ РУС дезоксирибонуклеиновой кислотой из плазмиды.Рекомбинантный ЭПО. полученный в клетках СНО, очищают традиционными методами колоночной хроматографии.Биологическую активность очищенного рекомбинантного ЭПО гл хлтго определяют известными методами (биопроба на пролиферацию клеток селезенки).Удельная активностью удгго полученного и очищенного рекомбинантного ЭПО составила 200000 ед./мг белка. Среднее значение находится в интервале 275000300000 ед./мл белка. Наблюдались значения выше чем 300000. Отношения активности п уйуо к активности Ел утго исследуемые для рекомбинантного ЭПО, равны 0.71.3.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. ЭПО очищают от мочи пациентов. страдающих апластической анемией. известным методом за исключением того. что опускают фенольную обработку и заменяют термообработкой при 80 С в течение 5 мин для инактивации нейраминидазы. Конечную стадию очистки проводят путем фракционирования на колонке С-4 /у 1 ас высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием от 0 до 95 ацетонитрильного градиента трифторуксусной кислоты (ТФК) в течение 100 мин. Положение ЭПО в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом М-концевой последовательностью основных пиков. ЭПО элюируют при 53 ацетонитрила и обнаруживают приблизительно 40 белка. подвергаемого высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции. содержащие ЭПО. выпаривают до 100 мкл. доводят до рН 7 бикарбоната аммония и обрабатывают 2 ым ТРСК-обработанным трипсином в течение 18 ч при 37 С. Полученные фрагменты подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой. как описано выше. Хорошо отделенные пики выпаривают почти до сухости и подвергают непосредственно анализу М-концевой аминокислотной последовательности. используя газофазный секвениатор модели 48 ОА. Определяют последовательность. приведенную в табл. 2 и 3. два фрагмента. полученные в результате обработки трипсином. отбирают для синтеза олигонуклеотидньлхзондов. Из последовательности Чад-АэлРЬе-Туг-АЯа-ТгР-Ьуз получают 17 мег со следующей нуклеотидной последовательностью.и 18 мег со следующей нуклеотидной после 0 довательностьюИз последовательности, Уад-Туг-Зег-АзпРле-Ьеи-Аго получают два пула 14-меров.ттсмтт ттсмтт ТАСАСТААСТТССТ и тАсАстААсттсттОлигонуклеотиды метят в 5-конце 32 Р, используя полинуклеотидную киназу и гамма 32 Р-АТР. Удельная активность Олигонуклеотидов варьирует между 1000 Зи 3000 дюймз/ммол олигонуклеотида. Геномную ДНК-библиотеку человека в бактериофаге лямбда подвергают скринингу. Приблизительно З.5 х 10 фага высеваютс плотностью 6000 фага на 150 мм чашку Петри со средой М 2 СУМ и инкубируют при 37 С до тех пор,пока пятна не станут видными. однако маленькими (приблизительно 0.5 мм). После охлаждения при 4 С в течение 1 ч дупликат ные реплики переносят на нейлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при37 С на чашках со свежими средами МХСУМ. Затем фильтры денатурируют итонкой пленке 0.5 Н МаОН-1 М Мас и 0.5 М Тгбз (рН 8) - 1 М МаС соответственно. Вслед за вакуумной сушкой при 8 ОС в течение 2 ч фильтры промывают в 5 х 55 С, 0,5 505 в течение 1 ч и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание снижает фоновое связывание зонда с фильтрами. Фильтры затем промывают водой и Предварительно гибридизируют от 4 до 8 ч при 48 С в ЗМ растворе тетраметиламмонийхлорида, 10 мМ МаРО 4 (рН 6,8). 5 х Веплагогэ. 0,5 505 и 10 мМ ЭДТК. 17 мег. меченый 3 Р. затем прибавляют при концентрации 0.1 пмол/мл и гибридизацию осуществляют при 48 С в течение 72 ч. Вслед за гибридизацией фильтры промывают экстенсивно в 2 х ЗБС (0.3 М МаС 0.О 3 М цитрат натрия, рН 7) при комнатной температуре и затем в течение 1 ч в ЗМ ТМАСР-10 мМ ыаРОа (рН 6.8) при комнатной температуре и от 5 до 15 мин при температуре гибриди 2876нейтрализуют в течение 10 мин каждого назации. Приблизительно 120 сильных дупликатных сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим экраном. Положительные сигналы отбирают, группируют в пулы из 8, пересевают и вновь подвергают скринингу с использованием 1/2 14 мег пула на каждом из двух фильтров и 127 мег на третьем фильтре. Условия высева и гибридизации при этом те же, но гибридизацию осуществляют при 37 С. Вслед за авторадиографией зонд с фильтра переносят в 50-ом формамиде в течение 20 мин при комнатной температуре и фильтр повторно гибридизируют при 52 С 18 мег зондом. Два независимых фага гибридизируют со всеми тремя зондами. ДНК из одного из этих фагов обозначают здесь Я-НЕРОЪ Переваривают рестриктазой 5 аи 3 А и субконируют в М 13 для анализа ДН К-последовательности.П р и м е р 2. 5 мкг мРНК человеческой печени эмбриона и мРНК печени взрослого человека подвергают электрофорезу в 0,8 ом агарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу.Однонитевый зонд получают из матрицы М 13, содержащей вставку. показанную в табл.1. Праймером является 20 мег. происходящий из того же фрагмента, что и первоначальный 17 мег зонд. Получают зонд за исключением того. что вслед .за расщеплением Зта малый фрагмент очищают от М 13 хроматографией на колонке с Сефарозой С 14 В и 0.1 М МаОН 02 ММаС. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 х 106 отсчетов в минуту сИ - П р и м е р 3. Зонд. идентичный описанному в примере 2. получают и используют для скрининга библиотеки кДНК печени эмбриона. полученной в векторе 11 -Сл 21 АИСПОЛЬЗУЯ стандартные МЕТОДИКИ СКрИНИН-га бляшек. Три самостоятельных положительных клона обозначены здесь А-НЕРОР 6 (1350 пар оснований), Я. НЕРОРЬ 8 (700 п.о.) и А-НЕРОР 1 З (1400 п.о.) выделяют вслед за скринингом 1 х 106 бляшек. Полную вставку Я -НЕРОР ЫЗ и А НЕРОР 16 секвенируются вслед за субклонированием в М 13 (табл. 7 и 5 соответственно). Только часть вставки А -НЕРОР 1.8 секвенируют. Остальные фрагменты считают идентичными двум другим клонам (табл.7). 5- и Знетранслируемые последовательности представлены строчными буквами. Кодирующая область представлена прописными буквами.В отношении табл.2 и 3 следует упомянуть. что определенная аминокислотная последовательность. показанная ниже нуклеотидной последовательности.пронумуерована начиная с цифры 1 для пертвойааминокислоты созревшего белка. Остат КИЧ ЦИСТЗИНЗ В СОЗРЗВШВМ белке- дополнительно указаны ЗН. и потенциаль ные М-сайты гликолизирования обозначены звездочкой. кДНК-клоны 11 -НЕРОР Ьб. А НЕРОР 8 и 11 -НЕРОР 1.13 задепонированы в АтегйсапТуре Сшшге Сонектйоп. Роскуйпе. Магуапо под номерами АТСС 40156. АТСС 40152 и АТСС 40153 соответственно. -П р и м е р 4. Геномные клоны 1 -НЕРО 1. А -НЕРО 2. Я. -НЕРО 3 и 1 -НЕРО 6 депонированы в АтегйсапТуре Сипиге Сопестбоп, Роскуте. Магуапо под номерами АТСС 40154, АТСС 40155. АТСС 40150 и АТСС 40151 соответственно.Используют вектор рАЦЭ 2 Б ЗА рА(З), эта плазмида содержит кдНК-ген дигидрофолятредуктазы мыши (ОРНР), который находится под контролем позднего промотора аденовируса 2 (Ао 2). 5-часть аденовирусной ДНК и 3 часть гена иммуноглобулина. между поздним промотором аденовируса 2 и ВРН Р-кодирующей последовательностью.рАЕ 26 рА(З) превращают в плазмиду рС//12. рА 026/ рА(З) превращают в плазмиду рАЦЭ 26-5/рА(3) делецией одного из двух сайтов Рэт 1 в плазмиде рАЦЭ 26/рА (3) путем частичного переваривания Рзг 1 и получают субпопуляцию плазмид. в которой только один сайт Рзт 1 расщеплен. затем осуществляют обработку и пигирова ние ферментом Кленова -- и. Ппазмиду рАЦЭ 26 З/рА (3) расщепляют Руи 11. Ппазмиду рА/43 переваривают ХНЫ, обрабатывают фрагментом Кленова. переваривают Руи 11 и выделяют электрофорезом в акрипамидном геле фрагмент размером 140 п.о. Фрагмент 140 п.о. лигируют с плазмидой рАЦЭ 26/ рА (З). обработанной с рестриктазой РуиН. Продукт лигирования используют для трансформации Е.соН. колонии подвергают скринингу с помощью зонда, меченого Р, комплементарного к фрагменту из 140 п.о. ДНК получают из положительно гибридизирующихся колоний.51/40, получают путем обработки ДНК 5/40ферментомдуа 1-1 фрагментом Кленова 6301 1 с последующей пигацией Хло 1-линкеров. ХНЫ-фрагментом и выделением фрагмента электрофорезом в геле. Этот фрагмент за 2876тем лигируют обработанной рестриктазой Хпо плазмидой рТР и получают плазмиду рСУЗУЬ 2-ТР 1.Ориентация фрагмента В 5 У 40 в рСУЗУЬ 2-ТР. такова. что позднийпромотор вируса 5/4 О находится в такой же. ориентации. что и основной поздний промо тор аденовируса т - . Для интродуцирования генов /А в рСУЗУЬ 2-ТР вначале конструируют плазмиду рВН 322, которая содержит в НйпсЛНсайте фрагмент В аденовируса типа 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают нэпаш и фрагмент В выделяют электрофорезом в геле. Этот фрагмент встраивают в плазмиду рВКЗ 22. которая предварительно была обработана НЕпсПП. После трансформации Е.соП отбираюгрекомбинанты и ориентировку встроенных фрагментов определяют путем обработки рестриктазами. рВК 322 А Ндпот В содержит фрагмент В НбпоШ аденовируса типа 2. Ппазмиду рВ 12322 А 1 НЕпШП В обрабатывают Нра 1. добавляют пинкеры Есот и гидролизуют Есот. Фрагмент. имеющий липкие концы ЕсоБЧ. встраивают в ЕсоЮ-сайт плазмиду РТ. гидролизованной ЕсоЮ. После трансформа тции штамма Е.соб НВ 101 отбирают коло нии. устойчивые к тетрациклину. далее на фильтрах колонии подвергают скринингу посредством гибридизации. ДНК получают из положительно гибридизирующих клонов и гидролизуют рестриктазами. Полученную плазмиду обозначают р 91023. Ппазмиду р 91023 гидролизуют рестрактазой Есок и получают два фрагмента. один около.7 кВ и другой около 1.3 кВ. Последний фрагментсодержит гены /А. Концы обоих фрагментов . заполняют-с-использованием фрагментгттКленова РоП и два фрагмента затем лигируют один к другому. Ппазмиду р 91023/АДсодержащую гены /А. являющуюся анало гичной плазмиде р 91023. однако потерявшую два сайта ЕсоЮ. идентифицируют посредством скрининга фрагментом гена/А. Один Ре П-сайт в плазмиде р 91023/М заменяют на Есодд-сайт. р 91023/М гидролизуют рестриктазой Ре 1 и обрабатывают фрагментом Кленова РоП для восстановления концов. ЕсоЮ-линкеры лигируют с тупым сайтом Рзт плазмиды р 91043/А/. Линейную плазмиду р 91023/Аи с Есотлинкерами. присоединенными к тупым сайтам Рзп. отделяют от несшившихся линкероа и гидролизуют Брод рестриктаза ми. после -чего по аторно 1 и 1 Ги 1 ру-У ийденти-фицируют плазмиду р 91023/ЗА которая аналогична р 91 О 23/А/. но вместо прежнего сайта Ран в ней содержится сайт Есогг.