Способ культивирования вируса гриппа лошадей штамма “А/equine/Otar/764/07″ типа H3N8, в культуре клеток

(51) 12 7/00 (2006.01) 12 1/92 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ клеточный монослой линии клеток сохранялся минимум 10 сут без признаков контаминации и спонтанных дегенеративных изменений. Таким образом, на основании проведенных исследований установлено, что банк прототипных клеток не содержит бактерий, грибов, микоплазм и вирусов, в процессе выполнения работы не происходило загрязнения клеточных культур. В экспериментах использовали восстановленную культуру клетоки на первом пассаже получена высокоактивная вируссодержащая суспензия гриппа лошадей с инфекционной активностью не менее 7,00 ЦД 50/см 3 и гемагглютинирующим титром не менее 1128. Отработаны оптимальные параметры культивирования вируса определена инфицирующая доза от 0,1 до 0,01 ТЦД 50,установлено что, для исследуемого штамма температура инкубирования составляет (340,5)С с продолжительностью культивирования 72 часа. Проведен анализ эффективности действия различных протеаз при протеолитическом расщеплении гемагглютинина вируса гриппа лошадей при культивировании в культуре клеток. При этом установлено, что комплекс 0,25 в концентрации 1100 оказывает наиболее эффективную репродукцию вируса гриппа лошадей в культуре клеток , в которой отмечено накопление вируса с инфекционной активностью 7,25 ТЦД 50/см 3 и гемагглютинирующим титром 1256. Следовательно, комплекс 0,25 является эффективным ферментом для протеолитической активации гемагглютинина вируса гриппа лошадей при культивировании в культуре клеток .(72) Абдураимов Ергали Орынбасарович Баракбаев Кайнар Базаркулович Сансызбай Абылай Рысбайлы Ершебулов Закир Джапарович Таранов Дмитрий Сергеевич Кайсенов Дастан Назбекович Зейнеттинова Динара Болатовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) . , . . пособ культивирования вируса в культуре клеток , 1968(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ГРИППА ЛОШАДЕЙ ШТАММА А///764/07 ТИПА 38, В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК(57) Объектом исследования - является штамм А/лошадь/Отар/764/07, вируса гриппа лошадей типа 38, выделенный от больных лошадей на территории Республики Казахстан в 2007 году сотрудниками НИИПББ с биологической активностью 7,95 ЭИД 50/0,2 см 3, депонированный в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК. Цель работы - культивирования вируса гриппа 38 в культуре клетокдля наработки активной вирусной биомассы, пригодной для изготовления диагностических наборов и профилактических препаратов. В процессе выполнения запланированных работ на первом этапе была восстановлена клеточная линия . Исследования показали, что Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и вирусологии,может использоваться для культивирования и наработки биомассы вируса гриппа лошадей в культуре клеток. Известен способ культивирования вируса в культуре клетокпо данным . ,. , 1968 клеткипо уровню чувствительности к вирусу гриппа А и по эффективности вирусологической диагностики не уступают, а иногда и превышают показатели репродукции вирусов на куриных эмбрионах и культуре почки обезьян. В работе использовали аттенуированные вирусы гриппа лошадей (ВГЛ) 1-го А/лошадь 1/Прага и 2-го подтипов А/лошадь 2/Франция/98, а также вновь изолированный эпизоотический штамм А/лошадь 2/Битца/07. Для получения вируссодержащей жидкости использовали культуру клеток . Отличием от вышеуказанного способа в нашем способе является то, что при культивировании используется эпизоотический штамм А/лошадь/Отар/764/07 вируса гриппа лошадей,выделенный от больных лошадей на территории Республики Казахстан сотрудниками НИИПББ в 2007 году,который обладает высокой инфекционной и гемагглютинирующей активностью. Данное изобретение включает в себя разработку параметров культивирования вируса гриппа лошадей типа 38 в культуре клеток, для наработки активной вирусной биомассы, пригодной для изготовления диагностических наборов и профилактических препаратов для ветеринарии. Результаты, полученные в ходе выполненной работы, будут внедрены в разрабатываемую технологию изготовления вакцинных препаратов. Культивирование штамма А/лошадь/Отар/764/07 вируса гриппа лошадей проводится следующим образом. Первым этапом проведенных исследований являлось определение уровня накопления вируса при различных дозах инфицирования. При этом использовали культуру клетокпри заражении в дозе от 0,0001 до 0,1 ТЦД 50/кл. Культивирование инфицированной культуры проводили при температуре (340,5)С и длительности 72 час. По окончании культиви рования матрасы с инфицированной культурой клеток замораживали при минус 70 С в течение 1214 час, затем оттаивали при комнатной температуре и проводили сбор вируссодержащей суспензии. В результате проведенных исследований была определена оптимальная заражающая доза для штамма А/лошадь/Отар/764/07 (38) вируса гриппа лошадей в культуре клеток. При инфицировании культур клеток вирусом в дозе от 0,1 до 0,01 ТЦД 50/кл наблюдается накопление вируса в титрах от 6,830,08 до 7,410,08 ТЦД 50/см 3, а гемагглютинирующий титр при этом составляет от 1128 до 1256. Использование дозы заражения вируса меньше 0,01 ТЦД 50/кл для наработки вируссодержащего материала в культуре клеток следует признать нецелесообразным, так как уровень накопления инфекционной и гемагглюти нирующей активности при этом значительно ниже(3,500,28 - 6,160,16 ТЦД 50/см 3). Таким образом, получены необходимые данные,при соблюдении которых возможно стабильно получать вирусную биомассу, пригодную для использования при производстве диагностических и профилактических препаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ культивирования штамма///764/07 включающий культиви рование в культуре клеток , отличающийся тем, что при культивировании доза заражения составляет от 0,01 до 0,1 ТЦД 50/кл, температура культивирования 340,5 С, длительность 72 часа, по окончании культивирования матрасы с инфицированной культурой клеток замораживают при минус 70 С в течение 12-14 часов, затем оттаивают при комнатной температуре и проводят сбор вируссодержащей суспензии.