Способ выявления нуклеопротеидного антигена вируса гриппа лошадей (H3N8)

(51) 12 7/04 (2006.01) 61 39/12 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Баймаханова Байкен Бекарыстановна Глебова Татьяна Ивановна Богоявленский Андрей Павлинович Березин Владимир Элеазарович Икранбегийн Риза Сансызбай Аблай Рыспаевич(73) Дочернее государственное предприятие Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Икранбегийн Р. Разработка иммуноферментных тест-систем для детекции антигенавируса гриппа А. // Доклады НАН РК. 2003. 4. с.57-63(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОПРОТЕИДНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГРИППА ЛОШАДЕЙ (38)(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и иммунологии, в частности, к серологической диагностике гриппа лошадей. На основе моноспецифических антител разработан метод ИФА-МС, для упрощенной иммуноферментной диагностики ВГЛ, позволяющий проводить определениеантигена вируса гриппа лошадей в практических и вирусологических лабораториях. Использование 96 этилового спирта в 1 концентрации для растворения субстрата бензидина позволило, сократить время проведения анализа на 10. Тест система ИФА-МС, сконструированная на основе моноспецифической анти-Р сыворотки к нуклеопротеидному антигену вируса гриппа лошадей характеризуется высокой степенью специфичности, не выявляет гетерологичные вирусные и хозяйские антигены,по чувствительности превосходит метода МИФА в 2 раза. Предлагаемый способ позволяет впервые определять вирус гриппа лошадей. 22291 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и иммунологии, в частности, к серологической диагностике гриппа лошадей. Известен способ экспресс - диагностики гриппа лошадей использующий реакцию иммунофлюоресценции в мазках - отпечатках со слизистой полости(К.П. Юров. Современные методы диагностики. 1991.- с. 203). До настоящего времени для ранней диагностики гриппозной инфекции у лошадей не применялся ИФА. Хотя в последние годы наблюдается активное развитие методов иммунохимического анализа, которые обеспечили решение важных проблем биологии и находят практическое применение в медицине и ветеринарии. Высокая специфичность и чувствительность этих методов анализа достигается применением специальных маркеров - изотопов, флюоресцирующих красителей. По своей чувствительности ИФА приравнивается к радио иммунологическому анализу и имеет ряд существенных преимуществ стабильность реагентов, меченных ферментами,отсутствие контакта с радио активными веществами,простота учетов результата (изменение окраски субстрата под действием фермента можно наблюдать визуально). В ветеринарной практике ИФА может быть использовано для проведения массовых обследований в целях ранней диагностики инфекционных болезней, наносящих огромный экономический ущерб животноводству, а также в ветеринарносанитарной экспертизе продуктов животноводства и сырья животного происхождения. Кроме того,данный метод позволяет контролировать иммунобиологическое состояние у животных и определить эффективность применения вакцин и сывороток. Известен способ диагностики (МИФА) вируса гриппа типа А, позволяющий определить наличие нуклеопротеидного антигена в биологических материалах с помощью моноспецифической антисывороткой. Сущность способа МИФА. На нитроцеллюлозную мембрану (НМ) диаметром 0,45 нмс помощью микропипетки наносят по 3-7 мкл исследуемого биологического материала, взятого от больных гриппом, в разведении 1100 и выше в 0,9 физиологическим растворе, после чего высушивают при комнатной температуре. Для удаления несвязавшегося белка, мембрану далее отмывают физиологическим раствором и инкубируют в блокирующем растворе (1 БСА в 0,01 М трисбуферном растворе рН 7.4) в присутствии 0,05 детергента Твин-20 в течение 1 ч при 37 С. После этого НМ-у отмывают промывочным буферным раствором (ПБР), состоящим из в 0,01 трисбуферного раствора с рН 7,4, 0.05 Твина-20, 5 раз по 5 мин. Затем на НМ накладывают лист хроматографической бумаги, пропитанной гипериммунной анти- сывороткой, разведенной буферным раствором для сыворотки (10 цельной лошадиной сыворотки в 0,01 М трис буферном растворе рН 7,4 0,05 Твин-20) и инкубируют в течение 15-60 мин. После повторной отмывки ПБР 5 раз по 5 мин на 2 пластину накладывают лист хроматографической бумаги, пропитанной конъюгатом антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена, разведенного в буферном растворе для сыворотки (1100-1400) и инкубируют в течении 30-60 мин при 37 С, после чего иммуносорбент отмывают ПБР от несвязавшегося конъюгата. Реакцию проявляют путем обработки иммуносорбента раствором субстрата (0,03 бензидин в 0,01 М трис- буферном растворе рН 7.4) при окислении которого формируется нерастворимый стойкий хромогенный комплекс. При этом в качестве окислителя используют 0,003 раствор Н 2 О 2. Результат положительная реакция на антиген проявляется в виде четко окрашенных пятен на иммуносорбенте, отрицательная реакция на антиген не вызывает появление окрашенных пятен на иммуносорбенте (Икранбегийн Р. Разработка иммуноферментных тест-систем для детекции антигенавируса гриппа А. //Доклады НАН РК. 2003. 4. с.57-63). Но этот способ не приемлем в отношении вирусов гриппа лошадей. По данным генетического анализа большого числа штаммов методом конкурентной РНК-РНК гибридизации установлено,что нуклеопротеидный антиген гриппа лошадей обладает хозяйской специфичностью, что отличает его от остальных вариантов вируса гриппа типа А. При диагностике гриппозной инфекции лошадей не целесообразно использование моноспецифической анти- сыворотки к вирусам гриппа типа А. Кроме того, недостатком этого метода является необходимость растворения используемого субстрата бензидина в водяной бане с температурой 100 С в течение 30 мин. В связи с этим, задачей изобретения является разработка иммуноферментной тест-системы на мембранном сорбенте (ИФА-МС) на основе моноспецифической антисыворотки для выявления нуклеопротеидного антигена вируса гриппа лошадей (ВГЛ) и способов устранения недостатов за счет модификации растворителя субстрата. Сущность изобретения На нитроцеллюлозную мембрану (НМ) диаметром 0,45 нмс помощью микропипетки наносят по 3-7 мкл исследуемого биологического материала (мазки из носа, сыворотки крови, 10 гомогенаты органов, в случае падежи), взятого от больных гриппом лошадей, в разведении 1100 и выше в 0,9 физиологическим растворе, после чего высушивают при комнатной температуре. Для удаления несвязавшегося белка мембрану далее отмывают физиологическим раствором и инкубируют в блокирующем растворе (1 БСА в 0,01 М трис- буферном растворе рН 7.4) в присутствии 0,05 детергента Твин-20 в течение 1 ч при 37 С. После этого НМ-у отмывают промывочным буферным раствором (ПБР), состоящим из в 0,01 трис- буферного раствора с рН 7,4, 0.05 Твина 20, 5 раз по 5 мин. Затем на НМ накладывают лист хроматографической бумаги,пропитанной моноспецифической антисывороткой к 22291 нуклеопротеидному антигену ВГЛ, разведенной буферным раствором для сыворотки (10 цельной лдшадиной сыворотки в 0,01 М трис буферном растворе рН 7.4, 0,05 Твин-20) и инкубировали в течение 15-60 мин. После повторной отмывки ПБР 5 раз по 5 мин на пластину накладывают лист хроматографической бумаги, пропитанной конъюгатом антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена, разведенного в буферном растворе для сыворотки (1800-11600) и инкубируют в течении 3060 мин 37 С, после чего иммуносорбент отмывают ПБР от несвязавшегося конъюгата. Реакцию проявляют путем обработки иммуносорбента 1 спиртовым раствором субстрата (0,03 бензидин в 0,01 М трис- буферном растворе рН 7.4) при окислении которого формируется нерастворимый стойкий хромогенный комплекс. При этом в качестве окислителя используют 0,003 раствор Н 2 О 2. Результат анализа учитывается визуально положительная реакция на антиген проявляется в виде четко окрашенных пятен на иммуносорбенте,отрицательная реакция на антиген не вызывает появления окрашенных пятен на иммуносорбенте. При разработке иммунологической диагностики необходимо уделять внимание в первую очередь,основным этапам выполнения тест системы, от которых зависит чувствительность и специфичность всего метода в целом. Основные этапы выполнения тест-системы включают 1. Получение основных компонентов антигена или анти-сыворотки и меченных антивидовых антител 2. Отработку основных параметров постановки анализа. В случае разработки ИФА тест-системы для выявления антигена, главным компонентом является получение анти-сыворотки,при чем чувствительность и специфичность разрабатываемой тест-системы впрямую зависит от качества получаемой анти-сыворотки. В свою очередь,активность получаемой анти-сыворотки зависит от качества используемого антигена. Пример 1 Получение нативного препарата антигенаэталонного штамма А/лошадь/Франция-2/98 (38),для разработки ИФА-МС Очищенную концентрированную вирусную суспензию эталонного штамма А/лошадь/Франция 2/98 (38) с инфекционной активностью 6,5 ЭИД обрабатывали в течение 18 часов при температуре 48 С неионным детергентом МЭСК в концентрации 10. После центрифугирования 30 мин при 30 000 об/мин осадок ресуспендировали в буферном растворе 0,05 М ФСБ, рН 7,2 и ставили на диализ для удаления детергента против 0,15 М растворана 24-48 часов. Чистоту полученного препарата нуклеопротеидного антигенапроверяли в электрофорезе в полиакриламидном геле. Полную очистку полученногоантигена от гемагглютинина проводили обработкой формализированными эритроцитами. Антигенную специфичностьантигена ВГЛ в сравнении сантигеном, полученным из эталонного штамма ///15/30 ,исследовали в ТФ-ИФА с нормальными сыворотками кролика и крыс, нормальной асцитной жидкостью мышей, поликлональными кроличьими сыворотками к вирусам гриппа А и В, моноклональными антителами к -белку. Нуклеопротеидный антиген эталонного штамма ///15/30 демонстрировал высокие значения величины относительного связывания с МКАТ, превышающие ВОС с поликлональными антисыворотками к вирусам гриппа А в 2 раза, а -антиген эталонного штамма А/лошадь/Франция-2/98(38) не реагировал с иммунной сывороткой к типу А и В вируса гриппа человека а также, с неиммунными сыворотками животных в разведениях выше, чем 1100, что указывало его антигенно-хозяйской специфичности (таблица 1). Пример 2 Получение гипериммунной моноспецифической анти- сыворотки к вирусу гриппа лошадей Для получения гипериммунной моноспецифической анти- сыворотки кролики были 2-кратно иммунизированы очищеннымантигеном, полученным от вирусной суспензии эталонного штамма А/лошадь/Франция-2/98 (38) подкожно в дозе 150 мкг/кролик с неполным адъювантом Фрейнда и внутривенно в дозе 150 мкг/кролик с интервалом 3 недели. Неполный адъювант Фрейнда использовался в соответствии с требованиями международных организаций и при этом,соотношение антиген/адъювант не превышало 11, объем в одну точку введения смеси не превышал 0,1 мл. Кровь собирали из ушной вены на 5, 7, 9 сутки. Суммарный объем собранной крови не превышал предельно допустимого значения. Полученную иммунную сыворотку освобождали от неспецифических ингибиторов прогреванием при температуре 56 С в течение 30 минут, и обрабатывали 0,5 периодатом калия. Определение титра антител, полученной моноспецифической анти- сыворотки, проводили в ТФ-ИФА и стандартным методом РТГА для выявления неспецифического связывания (таблица 2). Для избежания неспецифического связывания,анти- сыворотку адсорбировали очищенным вирусом гриппа. После очистки от неспецифических связываний и от неспецифических ингибиторов титр антител полученной анти- сыворотки понизился в 2 раза и в дальнейших экспериментах по отработке параметров разрабатываемой тест-системы использовали сыворотки с титром антител в ТФ-ИФА 16400 112800. Пример 3 Определение оптимальной дозы моноспецифической анти- сыворотки для приготовления иммуносорбента Оптимальную дозу моноспецифической антисыворотки определяли методом шахматного титрования (при одновременном титровании антигена и антител) используя в качестве выявляемого ею антигена - очищенныйантиген в 10 кратном разведении начиная 1 мкг/точку. Антиген наносили 3 22291 на НМ (, Германия, с диаметром пор 0,45 мкм) с помощью микропипетки в объеме 5 мкл,содержащий необходимое количество антигена на точку. Определенное количество антигена обрабатывали 2 кратным разведением, полученной моноспецифической анти- сыворотки начиная с 1400 (таблица 3). В качестве отрицательного контроля использовали нормальную кроличью сыворотку в таком же разведении, что и антисыворотка. Результаты экспериментов показали, что максимальный титр анти- сыворотки составлял 1204800 при концентрацииантигена - 1 мкг/точка. Выявление минимального количества -антигена 0.0001 мкг/точка происходило при разведении анти- сыворотки 1400-1800. Однако при таком разведении сыворотки появлялось неспецифическое связывание с антигенами нормальной кроличьей сыворотки в концентрации 1 мкг/точка. Таким образом, специфическое выявление иммунного комплекса происходило при разведении антисыворотки 11600 - 13200. Исходя из этого, за рабочую дозу анти- сыворотки брали е разведение, выявлявшееантиген ВГЛ в концентрации от 10 до 1 нг/точку (0,01- 0,001 мкг/точка). Пример 4 Определение оптимального времени инкубации иммуносорбента с моноспецифической антисывороткой и пероксидазным конъюгатом Результаты эксперимента показали, что через 3 минуты инкубации образца с моноспецифической анти- сывороткой на НМ начинали появляться комплексы антиген-антитело(таблица 4). Интенсивность окраски пятен возрастала к 60-ой минуте, далее оставаясь на одном уровне с выявлением 0,001 мкг белка связывавшего с антисывороткой. Влияние времени инкубации комплекса антигенантитело с конъюгатом на эффективность проявления пятен изучали с помощью различных концентрации антигенавируса гриппа (от 1 до 0.0001 мкг/точка) с анти- сывороткой и нормальной кроличьей сывороткой в разведении 11600 (таблица 5). Пример 5 Ускорение проведения анализа за счет модификации проявления реакции Бензидин, используемый в качестве субстрата,труднорастворим в воде (растворяется в водяной бане в течение 30 мин), быстро растворим в 96 этиловом спирте. Но субстраты бензидин и диаминобензидин,образуют при окислении нерастворимые в водных растворах крупные, окрашенные молекулярные комплексы, группировки которых способны к комплексообразованию с металлами с формированием стабильных комплексных соединений. Поэтому использование 96 этилового спирта должно быть минимум и оптимальный объем растворителя не должно превышать 1 от общего объема субстратной смеси. Результаты экспериментов представлены на фиг. 1. Предварительное растворе 4 ние субстратов в 96 этиловом спирте, что дало сокращение времени и четкость окрашивания. Пример 6 Сравнительное изучение чувствительности и специфичности методов ИФА-МС и МИФА Изучение чувствительности разработанной тестсистемы ИФА-МС по сравнению с МИФА проводили путем 10-кратного титрования(исходная концентрация 1 мкг/точка) в присутствии моноспецифической анти- сыворотки к вирусу гриппа лошадей (ВГЛ) в 2 кратном разведении от 1400 до 1102400 (фиг. 2). Из фигуры 1 видно, что выявление минимального и максимального количества белка при титрованииантигена в ИФА-МС 2 раза выше, чем при титрованииантигена в МИФА. Это свидетельствовало о более высокой чувствительности тест-системы ИФА-МС. Анализ специфичности анти- сыворотки осуществляли при использовании различных антигенов вируса гриппа типа А суммы внутренних антигенов сердцевины - , суммы наружных антигенов - , вирус ринопневмонии лошадей,вирус гриппа человека 32,а также гетерологичных вирусных и хозяйских антигенов в ИФА-МС и МИФА (таблица 6). Моноспецифическая анти- сыворотка не формировала иммунных комплексов с антигенами , белками разрушенных вирусов гриппа типа В, ринопневмонии лошадей,вируса гриппа человека 32, парагриппа типа 2,белками гомогената нормальных ХАО КЭ,нормальной кроличьей сывороткой. Это указывало на отсутствие неспецифического связывания антигена с антителом и свидетельствовало о строгой антигеннохозяйской специфичности используемой иммунной сыворотки кантигену ВГЛ. Таким образом, сконструированная высокоспецифичная иммуноферментная тест-система на мембранном сорбенте (ИФА-МС) на основе моноспецифической антисыворотки к нуклеопротеидному антигену ВГЛ позволяет определить 1-10 нгантигена в биологических образцах и превосходит по чувствительности 2 раза метода МИФА. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выявления нуклеопротеидного антигена вируса гриппа,включающий постановку иммуноферментного анализа путем нанесения исследуемого образца на нитроцеллюлозную мембрану с трехкратным последовательным ее контактированием с листами хроматографической бумаги, отличающийся тем, что диагностику проводят путем использования моноспецифической анти-сыворотки к нуклеопротеидному антигену вирусу гриппа лошадей и обработка иммуносорбента 1 спиртовым раствором субстрата (0,03 бензидин в 0,01 М трис- буферном растворе рН 7.4). 22291 Таблица 1 Антигенная специфичность препаратовв ТФ-ИФА Разв-ние Антисыв. А/лошадь/Франция 2/98///15/30 Количество, мкг/точка Количество, мкг/точка 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 МКАТ к- белку вирусам гриппа типа А человека и животных 1400 4.6 3.4 3.1 2.3 1800 4.2 3.3 2.3 11600 3.7 2.9 13200 3.1 16400 2.5 112800 2.2 125600 151200 1102400 1204800 Поликлонольная кроличья сыворотка к вирусам А и В человека и животных 1400 3.7 2.9 2.0 1800 3.1 2.0 11600 2.5 13200 2.2 16400 Нормальная кроличья сыворотка 1400 1800 11600 13200 Нормальная крысиная сыворотка 1400 1800 11600 13200 Нормальная асцитная жидкость мышей 1400 1800 11600 13200 Примечания 1- ВОС 2,1 - положительный результат 2 ВОС - величина относительного связывания антигена с антителом(ОП 492 нм опытного раствораОП 492 нм контрольного раствора). 22291 Таблица 2 Результаты определения антител в сыворотках кроликов после иммунизации очищеннымантигеном вируса гриппа лошадей Титр антител в ТФ-ИФА / РТГА Титр антител после обработки После После 2 иммунизации периодатом первой 5 сутки 7 сутки 9 сутки калия/цельным иммунивирусом зации,21 сутки 1110 16400 112800 125600 125600 112800110 140 140 140 180 110 2110 16400 16400 112800 112800 112800110 120 140 140 140 110 3110 16400 16400 16400 112800 16400110 120 140 140 180 110 Примечания 1 в знаменателе титр антител в РТГА (неспецифические связывания) 2- титр в РТГА после обработки анти- сыворотки цельным вирусом для удаления неспецифического связывания. До иммунизации Таблица 3 Определение рабочей дозы моноспецифической анти-Р сыворотки Разведен, сыв. 1 Концентрация белка антигена , мкг/точка Анти -сыворотка Нормальная кроличья сыворотка 0.1 0.01 0.001 0.0001 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 Влияние времени инкубацииантигена с моноспецифической анти- сывороткой на выявления комплекса антиген-антитело Время инкубации, мин 1 2 3 5 15 30 60 120 22291 Таблица 5 Влияние длительности инкубации иммуного комплекса с конъюгатом на количество выявляемого антигенаВремя инкубации, мин Детекцияантигена в комплексе с - сывороткой (11600) В положительном образце,В отрицательном образце мкг/точка 5 15 30 0.01 60 0.001 120 0.001 22291 Таблица 6 Результаты сравнительного изучения специфичности и чувствительности моноспецифической антисыворотки в ИФА-МС и МИФА с гетерологичными вирусными и хозяйскими антигенами Анти 1 ИФА-МС МИФА Количество белка антигена, мкг/точка Количество белка антигена, мкг/точка 0.1 0.01 0.001 0.0001 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Антиген - внутренние белки вируса гриппа - А(сое) Антиген - гликопротеиды вируса гриппа Антиген - вирус гриппа В Антиген - вирус гриппа человека 32 Антиген - вирус парагриппатипа Антиген - вирус ринопневмонии лошадей Антиген - гомогенат нормальных ХАО КЭ Антиген - нормальная кроличья сыворотка