Способ выделения вируса M картофеля (BK-M)

(51) 12 7/02 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Способ выделения вируса М картофеля относится к области иммунологии и основной сферой его применения является сельское хозяйство,а также в лабораториях, занимающихся получением диагностических наборов к вирусам картофеля. Целью предложенного способа является увеличение выхода вирусоспецифических белков и степени его очистки, путем сокращения времени и числа промежуточных этапов выделения вируса. В предлагаемом способе выделения ВК-М, после осветления суспензии органическими растворителями, окончательную очистку вирусного белка проводят двойным центрифугированием через сахарозную подушку, полученный осадок перерастворяют и осветляют три раза низкоскоростным центрифугированием. Применение улучшенного способа выделения ВК-М из инфицированных растений, увеличит выход вирусного белка, сократит число промежуточных этапов выделения, сэкономит время выделения белка и расход реактивов.(72) Манадилова Алия Молдахановна Тулеева Гульмира Туриказиевна Кунаева Рауза Минлиахмедовна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина Республиканского Государственного Предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСАКАРТОФЕЛЯ (-) Способ выделения вируса М картофеля относится к области иммунологии и основной сферой его применения является сельское хозяйство, а также в лабораториях, занимающихся получением диагностических наборов к вирусам картофеля. Картофель поражается многими возбудителями болезней и вредителями. Среди заболеваний картофеля вирусные болезни являются наиболее вредоносными. Обуславливаемые ими потери урожая велики и могут достигать 80 урожая. Для осуществления эффективного контроля вирусных заболеваний картофеля необходимы надежные и высокочувствительные тест-системы, основанные на использовании иммуноферментных методов анализа. Первым этапом успеха получения диагностикумов является быстрый и надежный метод выделения и очистки вирусов. Известен способ выделения вируса М дифференциальным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. В основе метода лежит гомогенизирование зараженного материала в калий - фосфатном буфере, очистка смесью хлороформ - тетрохлоруглерод. Дальнейшая очистка проходит через 20 сахарозную подушку с 3 мочевиной,и ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы (10-40) с последующим сбором фракций и определением оптической плотности каждой фракции (Николаева О.В., Новиков В.К., Каграманов В.Н., Бобкова А.Ф.,Атабекова И.Г. Определение М - и- вирусов картофеля методом иммуноферментного анализа // Сельскохозяйственная биология, 1985, 2, с.96101). Недостатком указанного метода являются большие потери вируса при разделении в сахарозном градиенте, длительность процесса его выделения, связанная с разделением фракций на градиентаторе, и последующей регистрацией плотности каждой фракции на спектрофотометре. Целью предложенного способа является увеличение выхода вирусоспецифических белков и степени его очистки путем сокращения времени и числа промежуточных этапов выделения вируса. Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе выделения вируса М, после осветления суспензии органическими растворителями, окончательную очистку вирусного белка проводят двойным центрифугированием через сахарозную подушку, полученный осадок перерастворяют и осветляют три раза низкоскоростным центрифугированием. Пример 1 Листья, зараженные вирусом М, гомогенизировали в 0,2 М калийфосфатном буфере 7,6 содержащем 0,2 меркаптоэтанола,3 мочевины и 1 тритон Х-100 в соотношении 1 г листьев в 2 мл буфера.(2 раза) супернатант собирали, а осадки отбрасывали. Супернатант эмульгировали с равной по объему смесью хлороформ - тетрохлоруглерод (в соотношении 11) и встряхивали в течение 10 мин. Эмульсию центрифугировали при 8000 в течении 20 мин., супернатант (водную фракцию) собирали, а нижнюю фазу органических растворителей отбрасывали. Далее верхнюю фракцию очищали дважды через 20 сахарозную подушку центрифугированием при 31000, в течение 3 часов. Осадок суспендировали в течение ночи в холодильнике при 4 С. Суспензию осветляли низкоскоростным центрифугированием (8000,10 мин) три раза. В результате очистки нами был получен очищенный вирусный препарат М-ВК. Выход М-вируса составил 2,0-2,5 мг на 100 г листьев.- форез выделенного препарата показал чистоту и специфичность выделенного вируса. Применение двойной очистки через сахарозную подушку, по сравнению с дифференциальным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы и последующим элюированием фракций,сокращает время выделения вируса в 2 раза, и уменьшает потерю белковой фракции. Использование предлагаемого способа выделения ВК-М обеспечивает по сравнению с существующим способом следующие преимущества 1. Сокращение этапов выделения вируса и соответственно времени выделения вируса в два раза. 2. Вследствии отказа от дифференциального центрифугирования в сахарозном градиенте (1040) и последующей сборки фракций, уменьшаются затраты на дорогостоящие реактивы. 3. Сокращение этапов выделения вируса ведет к уменьшению потери белковой фракции на стадии дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения вирусакартофеля из зараженных листьев табака,включающий гомогенизацию листьев, осветление супернатанта смесью хлороформ-тетрохлоруглерод и последующей очисткой водной фракции центрифугированием, отличающийся тем, что окончательную очистку вирусного белка проводят двойным центрифугированием через сахарозную подушку, полученный осадок перерастворяют и осветляют три раза низкоскоростным центрифугированием.