Иммобилизованный споровой пробиотик “ИНГО-3″

(51) 61 35/74 (2006.01) 61 35/20 (2006.01) 61 31/70 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Препарат включает носитель, представляющий собой сорбент, и живые споровые клетки Р-2 в титре 108-1010 КОЕ/мл,иммобилизованные на носителе-сорбенте. В качестве сорбента используют углеродный материал зауглероженную рисовую шелуху. Иммобилизованный спорвый пробиотик ИНГО-3 включает носитель-сорбент, клетки пробиотических бактерий и защитную среду (желатин, сахарозу и молоко) при следующем соотношении, в мас.клетки с титром 108-1010 КОЕ/г - 1,0-10,0 носитель-сорбент в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером 0,1-1,0 мм - 1,0-10,0 желатин - 15,0-20,0 сахароза - 5,0-10,0 молоко - 50,0-75,0. Иммобилизованный споровый пробиотик ИНГО-3 имеет более длительный срок хранения и эффективное пролонгированное лечебнопрофилактическое действие на всех участках желудочно-кишечного тракта за счет высокой колонизационной активности.(72) Кистаубаева Аида Сериковна Савицкая Ирина Станиславовна Жубанова Ажар Ахметовна Мансуров Зулхаир Аймухамедович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный университет им. аль-Фараби Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ СПОРОВОЙ ПРОБИОТИК ИНГО-3(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам микробиологического и медицинского назначения. Использование энтеросорбентов в качестве носителя для прикрепления споровых пробиотических микроорганизмов может обеспечить решение комплексной задачи детоксикации желудочно-кишечного тракта и нормализации его микроэкологии. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам микробиологического и медицинского назначения. Использование энтеросорбентов в качестве носителя для прикрепления споровых пробиотических микроорганизмов может обеспечить решение комплексной задачи детоксикации желудочно-кишечного тракта и нормализации его микроэкологии. Известны различные типы активных углей,например, карболонг, микросорб, и т.д. (Сенов П.Л. Фармацевтическая химия. - М. Медицина, 1978, С. 132-133 Патент РФ 2029546, МПК 6 А 61 9/16,опубл. 27.02.95 г.), карбонизованные плодовые косточки и зауглероженная рисовая шелуха,природные материалы и их аналоги(кристаллическая микроцеллюлоза,цеолиты,хитозаны, пектины и т.д.), синтетические минеральные сорбенты и другие материалы,которые используются для очищения организма от шлаков, радионуклидов, тяжелых металлов и токсинов. Энтеросорбенты снижают эффекты экзои эндотоксикозов. Однако энтеросорбенты не устраняют причин,вызывающих эффекты экзо- и эндотоксикозов, как правило, они не селективны, работают в основном на избыток субстрата, могут оказывать негативное действие из-за сорбции нужных для организма метаболитов(витаминов,гормонов) и не обеспечивают активную нормализацию микробиоценоза. Известен пробиотик бифидумбактерин-форте,содержащий лиофилизированную биомассу бифидобактерий - 106-109 КОЕ/мл бифидогенный компонент(лактозу или фруктоолигосахарид) - 100-987 мг/мл иммобилизатор (носитель - активированный уголь) - 10-41 мг/мл желатин - 0,2-1,5 мг/мл сахароза - 2,0-1,5 мг/мл. Дозированная лекарственная форма выполнена в виде таблеток или капсул, покрытых гастростойким покрытием из шеллака или ацетилфталилцеллюлозы. Недостатком данного препарата являются противопоказания при лактопатии. Известен биопрепарат - пробиотик Экофлор в сухой иммобилизированной форме, содержащий аминокислоты (мг/100 г сухой биомассы) глутаминовая кислота - 15,0-68,0 глутамин - 8,0-20,0 лейцин - 10,0-50,0 аргинин - 20,0-30,0 цистеин - 50,0-80,0 Клетки бифидобактерии В.1 или В.1, 791 или ЛВА-3 или В.379 или В.МС-42 в титре 108-1010 КОЕ/г защитную среду на основе желатина 0,1 - 10,0 иммобилизированные на сорбенте СУМС Однако в состав биопрепарата входит среда на молочной основе, которая нестандартна и, как правило, содержит следы антибиотиков и гормонов,что может вызывать побочное действие. Кроме того,биопрепарат имеет противопоказания для приема он не рекомендуется при лактозопатии, а также для приема ослабленным детям, т.к. сорбенты адсорбируют на свою поверхность витамины группы В и С. Известен бактериальный препарат бифидумбактерин сухой, содержащий высушенную культуру В.1, 791 - 106-107 КОЕ/мл в защитной среде желатин - 0,5 - 2,5 мг/мл сахароза - 0,5 - 2,5 мг/мл молоко обезжиренное - 2,5-5,0 мл. (Регламент производства бифидумбактерина 557-96). Препарат бифидумбактерин сухой, полученный по этой технологии, широко используется в медицинской практике. Однако недостатком данного препарата является невысокое содержание живых бифидобактерий в дозе. Кроме того, в состав препарата входит освобожденная от метаболитов биомасса, вследствие чего бифидобактерии быстро теряют жизнеспособность,что снижает стабильность и эффективность препарата. Наиболее близким аналогом является препаратпробиотик в иммобилизованной форме,включающий носитель, представляющий собой сорбент, и клетки эубиотиков, иммобилизованные на носителе энтеросорбент типа СУМС-1, причем клетки пробиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами,развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см 3/г в виде порошка, с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером 0,1-5,0 мм, или в виде таблеток при следующем количественном соотношении компонентов препарата, ма.клетки эубиотиков с титром 108-1010 КОЕ/мл 1,0-10,0 защитная среда - 0,1-10,0 носитель-энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла - остальное до 100. В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида,например,энтеросорбент типа СУМС-1, модифицированный углеродом, или энтеросорбент типа СИАЛ,модифицированный кремнийорганическим полимером. В качестве эубиотиков используют бифидо- или лактобактерии или их смесь (Патент РФ 2317089, МПК 6 А 61 35/74, опубл. 20.02.2008 г.). Однако указанный препарат имеет недостаточную колонизационную активность входящих в состав препарата бактерий-эубиотиков вследствие отсутствия стимулирующих добавок,ограниченные сроки хранения (не более 1 года), т.к. не содержит антиоксидантов и других стабилизирующих добавок. Задача изобретения - расширение ассортимента пробиотических биопрепаратов. Технический результат - получение нового высокоэффективного спорового пробиотика. Технический результат достигается предлагаемым иммобилизованным споровым пробиотиком ИНГО-3, включающим носительсорбент, клеткиР-2 с титром 108-1010 КОЕ/г, защитную среду, отличающимся тем, что в качестве сорбента-носителя используют зауглероженную рисовую шелуху, в качестве защитной среды - желатин, сахарозу и молоко, в качестве пробиотических бактерий - штаммыР-2 при следующем соотношении компонентов в мас.клетки споровых пробиотических бактерий штаммовР-2 с титром 108-1010 КОЕ/г - 1,0-10,0 носитель-сорбент в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером 0,1-1,0 мм - 1,0-10,0 желатин - 15,0-20,0 сахароза - 5,0-10,0 молоко - 50,0-75,0. Биотитр микробной биомассы в иммобилизованном споровом пробиотическом препарате 108-1010 КОЕ/г. Введение в сорбент микробной биомассы обеспечивает оптимальную биологическую активность препарату. Если исходная микробная биомасса имеет титр меньше 108 КОЕ/г, то препарат обладает недостаточной биологической активностью и при введении в желудочно-кишечный тракт проявляет слабый лечебно-профилактический эффект. Титр микробной биомассы в сорбенте более 1010 КОЕ/мл значительно увеличивает стоимость препарата без значительного увеличения лечебнопрофилактического эффекта. Основу жидкой бактериальной суспензии для сушки составляют клетки-пробиотики в молочной питательной среде с повышенным титром клеток 109-1011 КОЕ/мл жидкий концентратР-2. Молочная питательная среда с клеткамиэубиотиками содержит повышенное количество белка (не менее 15 СОМ - сухого остатка молока). Это позволяет увеличить антибиотические свойства бактерий пробиотиков в препарате. Кроме того,повышенное количество белка увеличивает антацидные свойства препарата. Высокая концентрация клеток в жидкой бактериальной суспензии позволяет использовать их в препарате в сухом виде в концентрации 0,1-10 с титром 1081010 КОЕ/мл. Перед сушкой антиоксидантные свойства жидкого концентрата дополнительно усиливаются с помощью специальной защитной среды, создающей максимальные условия перед сушкой, которые важны дляР-2, особенно при длительном их хранении в обычной атмосфере,содержащей кислород. Основными веществами защитной среды, являются молоко, желатин и сахароза. В качестве клеток споровых пробиотических бактерий используются клетки штаммов Р-2, которые обладают колонизационной активностью в кишечнике. Иммобилизующий материал - носитель-сорбент в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм,или в виде гранул размером 0,1-1,0 мм - помимо адсорбции бактерий-пробиотиков является сорбентом токсических веществ. Носитель-сорбент представляет собой карбонизованные частицы порошка или гранулы, поверхность которых модифицирована углеродом при получении сорбента ЗРШ. Сорбенты имеют удельную поверхность до 1200 м 2/г и развитую структуру мезо- и микропор. Размеры микропор сорбента соизмеримы с размерами микробных клеток, что позволяет заполнять мезо- и микропоры указанными клетками. Регулированием процентного содержания углерода в сорбенте с последующими окислительновосстановительными его обработками обеспечивается получение носителя с заданными гидрофильно-гидрофобными и другими топохимическими характеристиками. Сорбенты ЗРШ в меньшей степени, чем другие материалы,извлекают витамины и гормоны из организма и не нарушают перистальтику, что делает возможным их применение длительными курсами. Мезо- и микропористая структура носителя-сорбента, ячейки которого заполнены микробными клетками, также способствует защите этих иммобилизованных клеток от инактивирующих факторов внешней среды. Причем, микробные клетки, находящиеся в порах, и клетки, находящиеся близко к внешней поверхности носителя-сорбента, отличаются по своим десорбционным способностям, и такая неоднородность свойств клеток обеспечивает пролонгированное действие препарата и способствует колонизации не только верхних, но и нижних отделов кишечника. Пористый носитель,являясь энтеросорбентом,снимает эффекты местного токсикоза, что способствует выживаемости бактерий препарата и микрофлоры кишечника, а также снижает нагрузку на органы детоксикации человека или животного. Кроме того, при использовании в препарате в качестве клеток споровых пробиотических бактерий штаммовР-2 обеспечивается не только вытеснение из желудочно-кишечного тракта патогенных микроорганизмов(за счет антагонистических свойств указанных бактерий), но и восстановление сильно сокращенной микрофлоры кишечника при дисбактериозе и других заболеваниях. При свободном объеме пор сорбента менее 0,01 см 3/г не обеспечивается достаточное количество иммобилизованных микробных клеток в препарате(менее 0,1). Препарат с содержанием микробной биомассы менее 0,1 мас.имеет низкий биотитр с преобладанием прочно связанных с сорбентом клеток, т.е. действует преимущественно как энтеросорбент. Свободный объем пор используемых носителейсорбентов составляет не более 1,0 см 3/г, то есть количество микробной биомассы (клетки и компоненты питательной среды), которое может 3 быть размещено в порах сорбента, не превышает 1,0 см 3 на 1,0 г сорбента, т.е. на сорбенте может быть иммобилизовано микробных клеток до 50 ма. . Однако количество микробных клеток,вводимых в препарат, не превышает 10 мас.вследствие чего вся биомасса бактерий препарата находится в защищенном состоянии. При этом носитель-сорбент ЗРШ в препарате сохраняет свои основные свойства, обеспечивающие связывание и выведение из кишечника токсинов, продуктов незавершенного метаболизма и патогенных микроорганизмов. Ниже приведены примеры составов предлагаемого спорового пробиотического препарата ИНГО-3. Пример 1. Носитель-сорбент в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером 0,1-1,0 мм с иммобилизованными клетками пробиотических бактерий (мас. )Р-2 в титре 108-1010 КОЕ/мл - 1,0 носитель-сорбент - 1,0 желатин -15,0 сахароза - 5,0 молоко - 50,0. Пример 2. Носитель-сорбент в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером 0,1-1,0 мм.) с иммобилизованными клетками споровых пробиотических бактерий (мас. )Р-2 в титре 108-1010 КОЕ/мл - 5,0 носитель-сорбент - 5,0 желатин -10,0 сахароза - 15,0 молоко - 60,0. Пример 3. Носитель-сорбент в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером 0,1-1,0 мм.) с иммобилизованными клетками споровых пробиотических бактерий (мас. )Р-2 в титре 108-1010 КОЕ/мл защитной среды, в том числе клетки пробиотических бактерий с титром 108-1010 КОЕ/г - 10,0 носитель-сорбент - 10,0 желатин - 20,0 сахароза -10,0 молоко - 75,0. Пример 4. Технология получения готовых форм спорового пробиотика ИНГО-3. По специальной технологии готовят исходные сорбенты типа зауглероженная рисовая шелуха(ЗРШ) (СТ ДГП 39319819-03-2007), в котором описана зауглероженная рисовая шелуха(поверхность которой карбонизована,т.е. модифицирована углеродом при получении сорбента ЗРШ черного цвета.) с требуемой пористой структурой и химической природой поверхности и размером частиц (или гранул). Перед иммобилизацией споровых пробиотиков носитель-сорбент типа ЗРШ стерилизуют при температуре 121 С в течение 30 минут и охлаждают. В емкость при комнатной температуре загружают носитель-сорбент в виде порошка или 4 гранул и жидкий концентрат споровых бактерийР-2, после контакта клеток споровых бактерий с сорбентом добавляют защитную среду при определенных соотношениях и биологической активности споровых бактерий, соответствующих примерам 1-3. Смесь периодически перемешивают в течение 1,5-2,0 часов при температуре 4 С для полной иммобилизации клеток на носителе. Процесс иммобилизации возможно вести на качалке в стеклянной посуде или на роллерной установке. Далее продукт однократно промывают в изотоническом растворе . Мутный раствор стерильно сливают, отбирают пробы и проводят контроль полноты процесса иммобилизации по МУК 4.2.577-96 (Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов, п. 7.1 и п. 7.10. ФГУП НТЦ ИНФОРМРЕГИСТР 0320301011, действует с 29.10.1996 г., выдано свидетельство о регистрации 3500 от 29.10.2003 г.). Процесс считается завершенным, если в растворе осталось не более 50 от исходного количества клеток лактобацилл. Отмытый продукт замораживают в низкотемпературном холодильнике типа Кельвинатор при температуре минус 40-45 С в течение 24-48 часов. Кассеты с предварительно замороженным препаратом перегружают в сушильную камеру при достижении температуры плит минус 20-30 С и камеру вакуумируют. Готовый споровый пробиотик ИНГО-3 в сухой иммобилизованной форме фасуют во флаконы и герметично закрывают пробками. Массовая доля влаги составляет не более 3,5. Пример 5. Исследование влияния спорового пробиотика ИНГО-3 на кишечную микрофлору лабораторных животных. Для проверки эффективности действия созданного спорового пробиотика ИНГО-3 и его отсроченного полезного эффекта по колонизации кишечника были проведены исследования на лабораторных беспородных белых мышах обоего пола. Препарат Бифидумбактерин-форте, содержащий только один энтеросорбент, и заявляемый споровый пробиотик ИНГО-3 вводили мышам перорально,задавая его с кормом в дозе 0,5 г/кг веса тела (для одних опытных групп мышей) и 2,0 г/кг веса тела(для других опытных групп мышей) в течение 15 дней. При приеме спорового пробиотика ИНГО-3 нарастание веса животных происходило плавно и соответствовало нормам,принятым в популяционном стандарте. При приеме препарата Бифидумбактерин-форте динамика изменения веса у мышей носила переменный характер с резкими подъемами и спадами. Это объясняется сильным сорбционно-детоксикационным эффектом энтеросорбента, в результате действия которого улучшается всасывание питательных веществ,поступающих в организм. При приеме спорового пробиотика ИНГО-3 последствия сорбционнодетоксикационного эффекта сглаживаются и организм испытывает меньше стрессовых нагрузок. Данные по микробиологическим исследованиям состава микрофлоры кишечника мышей путем бактериологического анализа их фекалий приведены в таблицах 1 и 2. Таблица 1 Влияние препарата ИНГО-3 на состав кишечной микрофлоры мышей Количество микробов в 1 г фекалий Бифидумбактерин-форте ИНГО-3 Через 15 Через 12 Через 15 Через 12 дней дней дней дней отмены приема отмены приема 4 4 6 10 10 10 106 5 5 7 10 10 10 107 5 5 7 10 10 10 107 4 5 9 10 10 10 109 Анализ данных в таблице 1 позволяет сделать заключение, что длительное введение в течение 15 дней препарата Бифидумбактерин-форте и заявляемого спорового пробиотика ИНГО-3 в дозировке 0,5 г/кг веса тела вызывает не только количественные, но и качественные изменения в составе микробных ассоциаций кишечного тракта. Так, если в контрольной группе выявлено наличие. и лактозонегативной, то через 15 дней применения пробиотика ИНГО-3 из кишечника исчезает вся условно-патогенная флора, возврата которой не наблюдается через 6 и 12 контрольных дней после отмены препарата. При этом отмечается увеличение количества аутохтонной микрофлоры лактобацилл с 105 до 107 КОЕ в 1 г фекалий. Несколько иным является эффект воздействия препарата Бифидумбактерин-форте в такой же дозировке - 0,5 г/кг веса тела животного в течение 15 дней. Данные микробиологического анализа состава кишечной микрофлоры мышей показали,что препарат Бифидумбактерин-форте, адсорбируя на своей поверхности бактерии, полностью выводит из кишечника., в то время как лактозонегативную- только частично. При этом препарат Бифидумбактерин-форте также адсорбирует и полезную микрофлору - бифидо- и лактобактерии, а также лактозоположительную(1 ас), снижая их концентрации с величин порядка 105-106 до 104-105 КОЕ в 1 г фекалий. Кроме того, в случае применения ИНГО 3 у мышей исчезал запор - характерный побочный эффект при приеме препарата Бифидумбактерин форте. Через 12 дней после отмены приема биопрепарата-пробиотика ИНГО-3 концентрация полезных бифидо- и лактобактерий в кишечнике остается неизменной. Таким образом,результаты таблицы 1 свидетельствуют, что в отличие от ИНГО-3 препарат Бифидумбактерин-форте вызывает уменьшение в 10 раз концентрации полезной микрофлоры в кишечнике (бифидобактерий и лактобактерий) - вымывание полезных бактерий. Введение в организм максимальных доз препаратов Бифидумбактерин-форте и ИНГО-3 2 г/кг веса тела животных в течение 15 дней показало неэффективность действия доз,превышающих 0,5 г/кг веса тела. Данные приведены в таблице 2. Таблица 2 Влияние Бифидумбактерин-форте и ИНГО-3 на состав кишечной микрофлоры мышей в дозе 2 г/кг массы тела Количество микробов в 1 г фекалий Бифидумбактерин-форте ИНГО-3 Через 15 дней Через 12 Через 15 дней Через 12 дней приема дней приема отмены отмены 105 105 105 105 5 5 6 10 10 10 106 5 5 5 10 10 10 105 5 Количество микробов в 1 г фекалий Бифидумбактерин-форте ИНГО-3 Через 15 дней Через 12 Через 15 дней Через 12 дней приема дней приема отмены отмены 105 105 107 108 5 7 10 10 104 104 105 Из анализа данных таблицы 2 следует, что применение препарата ИНГО-3 в дозе 2 г/кг способствует полному вытеснению условнопатогенной микрофлоры. У мышей контрольной группы такого не наблюдается. Однако при этом происходит недостаточное повышение количества бифидо-, лактобактерий и(1 ас). У животных,потреблявших препарат Бифидумбактерин-форте, как видно из таблицы 2,наблюдается сильный дисбактериоз, поскольку полезная микрофлора содержится в количествах, не превышающих 105 КОЕ в 1 г фекалий. В результате через 15 дней после применения препарата Бифидумбактерин-форте и через 12 дней после его отмены освобожденные от полезных бактерий места на слизистой кишечника занимают условно-патогенные и патогенные бактерии(слабоферментирующая кишечная палочка, протей, сальмонеллы), особенно при применении препарата Бифидумбактерин-форте в повышенной дозе (см. таблицу 2). Пример 6. Исследование биологической активности препаратов в иммобилизованной форме в процессе их хранения. Для исследования биологической активности препаратов-пробиотиков в иммобилизованной форме в процессе воздействия инактивирующих факторов внешней среды (температура, кислород воздуха, длительность воздействия и другие факторы) используют стандартную процедуру ускоренного хранения биопрепарата при температуре 37 С. Результаты биотитрования стандартным методом серийных разведений на питательных средах в колонийобразующих единицах (КОЕ) на 1 г препарата (КОЕ/г) приведены в таблице 3. Таблица 3 Исследование влияние процедуры ускоренного хранения на биологическую активность (биотитр) препаратов Исходный Биотитр КОЕ/г Жидкий концентрат лактобацилл 1010 Сухой концентрат лактобацилл 105 Бифидобактерии на активированном угле 105 Бифидумбактерин-форте 108 Лактобактерии на СУМСе, прототип 108 ИНГО-3 108 Вид препарата Анализ таблицы 3 показывает, что по результатам ускоренного теста на хранение заявляемые препараты-пробиотики на основе концентрата бифидобактерий или лактобацилл в иммобилизованной форме имеют биологическую активность в 1,5-2,0 раза выше, чем комплексный препарат-прототип и на 1-2 порядка выше, чем другие препараты-аналоги. Хранение заявляемых препаратов в течение 1,5 года при температуре не выше 10 С в условиях холодильника показало, что их биологическая активность (в КОЕ/г) осталась практически неизменной, несмотря на наличие атмосферного 6 Биотитр препарата после хранения при 37 С 108 107 107 107 107 108 Кратность падения титра через 14 суток (разы) 425 59 18 5,7 58 5,4 воздуха в препарате над флаконом, что подтверждает данные ускоренного теста,приведенного в таблице 3. Таким образом, заявляемый иммобилизованный споровый бактериальный пробиотик ИНГО-3 обеспечивает более эффективное лечебнопрофилактическое действие на организм человека или животного за счет более высокой колонизационной активности в кишечнике, а также имеет более длительные сроки хранения. Возможно производство и промышленное применение предлагаемого препарата. Изобретение относится к биотехнологии, медицине и микробиологии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Иммобилизованный споровый пробиотик ИНГО-3, включающий носитель-сорбент, клетки пробиотических бактерий с титром 108-1010 КОЕ/г и защитную среду, отличающийся тем, что в качестве сорбента-носителя используют зауглероженную рисовую шелуху, в качестве защитной среды желатин, сахарозу и молоко, в качестве пробиотических бактерий штаммы Р-2 при следующем соотношении компонентов, в мас. клетки споровых пробиотических бактерий штаммовР-2 с титром 108-1010 КОЕ/г 1,0-10,0 носитель-сорбент в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером 0,1-1,0 мм 1,0-10,0 желатин 15,0-20,0 сахароза 5,0-10,0 молоко 50,0-75,0.