Средство для профилактики и комплексной терапии онкозаболеваний

(51) 61 39/40 (2006.01) 61 39/05 (2006.01) 61 35/00 (2006.01) 61 35/14 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Сущность изобретения - средство, имеющее следующий состав ингредиентов (мас.) чистая культура 2 (ИМВ В-38),-108 КОЕ/г- 30-33 чистая культура-Б-3 (ИМВ 78) -108 КОЕ/г 30-33 чистая культура живых-15 (ИМВ-1) -10 КОЕ/г - 30-33 пищевые волокна ГОСТ 9164-002-11866470-94 остальное. Технический результат повышение эффективности применения пробиотических препаратов при лечении онкобольных за счет введения в их состав микроорганизмов, способных не только восстанавливать микробиоценоз кишечника больного после лучевой и химиотерапии, но и активно подавлять опухолевый рост, а также обладающих устойчивостью к применяемым лечебным препаратам при их совместном применении.(72) Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна Саданов Аманкелди Курбанович Баякышова Куанышкул Турлыбаева Зере Жаиковна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ(57) Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для профилактики и комплексной терапии онкозаболеваний, а также снижения у онкобольных вероятности инфекционных осложнений. Изобретение относится к области биотехнологии и медицине и может быть использовано в качестве лечебно- профилактического средства против онкозаболеваний. Начиная с 60-х годов, после обнаружения антиканцерогенной и антимутагенной активности молочнокислых бактерий их рекомендуют применять в качестве противоопухолевых средств. Противоопухолевую активность лактобацилл связывают со способностью ингибировать образование канцерогенов и инактивировать фекальные бактериальные энзимы, конвертирующие проканцерогены,-гиалуронидазы, азоредуктазы,нитроредуктазы,-глюкозидазы,-глюкуронидазы(Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой. М ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ. 2002. с.608 Глушанова Н.А. Биологические свойства лактобацилл // Бюллетень сибирской медицины. 2003. 4. 50-55). Имеются многочисленные сведения о способности лактобацилл к влиянию на систему иммунитета,которое проявляется в стимуляции фагоцитарной активности нейтрофилов, макрофагов, синтеза иммуноглобулинов, образования интерферонов,интерлейкинов и фактора некроза опухолей Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева,В.В. Поспеловой. М. ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ.- 2002. - 608 с Цой И.Г., Сапаров А.С.,Тимофеева И.К. Иммуностимулирующее действие лактобактерий на цитотоксичность естественных клеток-киллеров и продукцию интерферона // Журн. микробиол. 1994. 6. с.112-113., .//. . - 1993. . 12. .207-220, ., - ..// .. - 1995. . 78. .491- 497). Большинство исследователей рекомендует применять пробиотические препараты для восстановления нормофлоры кишечника после интенсивной антибактериальной, лучевой или гормональной терапии. Наиболее близким к заявляемому изобретению является комлексный пробиотический препарат ЭМ-курунга (продукция НПО ЭМ-Центр, г. УланУдэ) с высоким содержанием бифидобактерий и лактобактерий, рекомендуемый для использования в реабилитационных программах больных с онкогематологической и другой онкологической патологией после лучевой и полихимиотерапии. Недостатком средства является отсутствие у него противоопухолевой активности. Задачей изобретения является повышение эффективности применения пробиотических препаратов при лечении онкобольных за счет введения в их состав микроорганизмов, способных не только восстанавливать микробиоценоз кишечника больного после лучевой и 2 химиотерапии, но и активно подавлять опухолевый рост, а также обладающих устойчивостью к применяемым лечебным препаратам при их совместном применении. Это достигается тем, что для профилактики онкозаболеваний и их комплексной терапии предложено средство, условно названное нами Биогарант-полилактовит-А-5 , состоящее из смеси жизнеспособных молочнокислых бактерий-2 (ИМВ В-38),(ИМВ-1),выпускаемое в жидком виде с добавлением пищевых волокон. Исследование различных композиций показало,что наиболее выраженный эффект достигается при использовании микробных культур в равных соотношениях. Жидкий препарат имеет следующий состав ингредиентов (мас.) чистая культура-2-108 КОЕ/г-33 чистая культура-Б-3 - 108 КОЕ/г-33 чистая культура живых-15 108 КОЕ/г -33 пищевые волокна ГОСТ 9164-00211866470-94 - остальное. Жидкий препарат готовят из раздельно выращенных бактериальных культур, смешанных в равных соотношениях,или же культуры выращивают совместно при использовании их посевного материала в равных соотношениях. Средство обладает помимо противоопухолевой активности высокой противолучевой и реактивирующей активностью,а также способностью подавлять широкий спектр патогенных и условно-патогенных бактерий благодаря целенаправленному отбору в его состав штаммов молочнокислых бактерий - антагонистов к наиболее часто встречающимся возбудителям заболеваний,.,, -5 ( Ин. Патент 17845. Средство для профилактики болезни Ньюкасла). Благодаря высокой противоопухолевой,противолучевой и антимикробной активности предложенное средство найдет применение в медицине как биологически активный препарат для комплексной терапии и профилактики онкозаболеваний, а также снижения у онкобольных вероятности инфекционных осложнений. Сущность изобретения подтверждается конкретно приведенными примерами. Пример 1. Культуры бактерий Б-3 и-15 для получения ассоциации Биогарант-полилактовит-А-5 засевают каждую отдельно в питательную средуследующего состава (г/л) дрожжевой экстракт(4)2 4 - 1,0. Выращивают при 37 С в течении 24 часов. Для получения ассоциации 1-суточные культуры смешивают в различных соотношениях. Противоопухолевую активность индивидуальных культур и ассоциации определяют на модели противоопухолевого роста - вторичном росте гриба. Гриб выращивают на среде следующего составафруктоза-2,0 (4)2 4 - 0,3 О 472 О - 0,025- 0,25 К 2 НР 4 - 0,01 КН 2 РО 43 Н 2 - 0,1 агар 2,0. Для определения противоопухолевой активности ассоциации и индивидуальные культуры вносят в расплавленную и охлажденную питательную среду в концентрации 2,0 и 5,0. Затем среду засевают конидиями гриба и выдерживают в термостате три недели. При периодических просмотрах в течение 3-4 недель учитывают сроки появления и частоту образования вторичных опухолеподобных колоний. Об ингибирующем действии испытуемых культур судят по отсутствию вторичных колоний, уменьшению их числа и размеров. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из представленной таблицы, наиболее выраженный эффект достигается при использовании микробных культур в равных соотношениях. Пример 2. Культуры бактерий Б-3 и-15 для получения ассоциации Биогарант-полилактовит-А-5 засевают в питательную среду в разных соотношениях и выращивают совместно при 37 С в течение 24 часов на питательной средевышеописанного состава. Противоопухолевую активность ассоциации определяют аналогично примеру 1. Результаты опыта представлены в таблице 2. Как видно из представленной таблицы,ассоциация Биогарант-полилактовит-А-5,приготовленная при совместном культивировании составляющих ее культур микроорганизмов,засеянных в разных соотношениях, обладает способностью подавлять опухолеподобный рост гриба Полное подавление опухолеподобного роста происходит при внесении в ростовую среду культур 2, . -15 (ПКБ -15) и .Б-3 в равных соотношениях. Таким образом,с помощью модели противоопухолевого роста выявлена ассоциация из молочнокислых и пропионовокислых бактерий,обладающая высокой противоопухолевой активностью преимущественно при равном соотношении входящих в нее бактерий. Пример 3. Культуры бактерий-15 выращивают совместно аналогично примеру 2 при засеве культур в равных соотношениях. Изучение противоопухолевой активности проводят в РГП Научный центр противоинфекционных препаратов Министерства индустрии и новых технологий РК. В исследованиях используют следующие тест-системы) Гепатоцеллюлярная карцинома человека,- культура клетокэмбриональная рабдомиосаркома человека,- культура клеток Н 9 ( ) лимфома человека. Активность ассоциации изучают в следующих разведениях 12 14 18 116 132 164 1128 1256. Через 72 часа воздействия ассоциацией Биогарант-полилактовит-А-5 на опухолевые линии клеток человека различного органного происхождения (2,и Н 9) проводят оценку возможного противоопухолевого действия. Эффективность действия препарата на опухолевую линию определяют по способности подавлять развитие клеток на 555. Результаты исследований представлены в таблицах 3-5. При определении возможного противоопухолевого действия ассоциации Биогарант-полилактовит-А-5 на модели опухолевой линии клеток 2 выявлено (таблица 3), что препарат обладает противоопухолевой активностью в трех максимальных разведениях 1/2,1/4 и 1/8, статистически достоверно подавляя развитие клеток данной линии на 75,2, 83,6 и 66,соответственно. При определении возможного противоопухолевого действия ассоциации Биогарант-полилактовит-А-5 на модели опухолевой линии клетоквыявлено (таблица 4),что препарат обладает противоопухолевой активностью в пяти разведениях 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 и 1/32, статистически достоверно подавляя развитие клеток данной линии, Ингибирование происходит на 78,9, 65,3, 93,9, 91,6 и 80,2, соответственно. При определении возможного противоопухолевого действия ассоциации Биогарант-полилактовит-А-5 на модели опухолевой линии клеток Н 9 выявлено (таблица 5),что препарат обладает противоопухолевой активностью в трех максимальных разведениях 1/2,1/4 и 1/8, достоверно подавляя развитие клеток данной линии на 93,5, 92,3 и 88,5, соответственно. В качестве сравнения в исследованиях используют три противоопухолевых препарата различного действия доксорубицин (таблицы 6-8),циклофосфамид (таблица 9) и 5 Фторурацил таблицы 10-11). Установлено, что противоопухолевая активность ассоциация Биогарант-полилактовит-А-5 в разведении 18, определенная на культуре клеток 2,сопоставима с антибиотиком доксорубицином в концентрации 15,6 мкг/мл и циклофосфамидом в концентрации 4,4 мкг/мл. Активность ассоциации Биогарант-полилактовитА-5 (разведение 12) в отношении культуры клетоксопоставима с доксорубицином в концентрации 7,8 мкг/мл и циклофосфамидом в концентрации 4,4 мкг/мл. В отношении культуры клеток Н 9 3 противоопухолевые препараты активность не проявили. У препарата 5 Фторурацил противоопухолевая активность в отношении культур клеток 2,и Н 9 не выявлена. Таким образом, на опухолевых линиях клеток человека различного органного происхождения(2,и Н 9) установлена противоопухолевая активность ассоциации Биогарант-полилактовит-А 5,сопоставимая с противоопухолевыми препаратами доксорубицином и циклофосфамидом. Пример 4. Культуры бактерий-15 выращивают совместно и индивидуально аналогично примерам 1-2. Устойчивость молочнокислых,пропионовокислых бактерий и ассоциации к противоопухолевым препаратам адриамицину(доксорубицину) и метатрексату в концентрациях 1,2,10,100 и 1000 мкг/мл определяют диффузионным методом. Установлено,что исследованные пробиотические микроорганизмы и ассоциация проявили устойчивость к обоим антибиотикам. Пример 5. Культуры бактерий-15 выращивают совместно аналогично примеру 3. Противолучевую и реактивирующую активность ассоциации определяют на тест-культуре . при облучении ее УФ-лучами. При определении противолучевой активности в суспензию тест-культуры Е.перед облучением добавляют ассоциацию в количестве 2,0 и 5,0. Затем 4,5 - 5 мл суспензии Е. , наливают в плоские стеклянные чашки Петри диаметром 10 см и облучают УФ-лучами, источником которых служит установка из двух ламп БУФ-15 (мощностью 30 Вт), смонтированных параллельно. Лампу устанавливают на расстоянии 25 см над облучаемой чашкой, что составляет дозу 30 эрг/мм за 1 сек. Облучение проводят в течение 30 сек. Перед посевом на плотную среду эндо суспензию бактерий разводят так, чтобы в чашках Петри выростало 50300 колоний. Для каждой точки проводят облучение трех независимых суспензий и из каждой суспензии делают высев в три чашки. Среднее значение рассчитывают при подсчете числа колоний в девяти чашках. Затем определяют индекс деления, который выражают как число клеток, образующих колонии в присутствии протектора,к числу клеток,образующих колонии без протектора. Результаты представлены в таблице 12. По результатам опыта установлена высокая проотиволучевая активность у ассоциации Биогарант-полилактовит-А-5 при использовании ее в качестве протектора в концентрации 2 и 5. При этом количество клеток . в опыте практически не отличается от исходного. Так, если в контрольном варианте исходное количестве клеток Е.составляет 2,9109 КОЕ/мл, а после облучения 5,0104, то в варианте с ассоциацией Биогарантполилактовит-А-5 сохраняется после облучения 2,1 109 КОЕ/мл жизнеспособных клеток Е. . Для определения реактивирующего эффекта в суспензию облученных клеток Е.добавляют 2 и 5 нативной культуры, выдерживают 30 минут,затем определяют количество жизнеспособных клеток. Результаты представлены в таблице 13. Установлено, что ассоциация Биогарантполилактовит-А-5 обладает выраженным восстанавливающим эффектом. В концентрации 2 и 5 она восстанавливает жизнеспособность облученной культуры Е.с 1,0104 КОЕ/мл после облучения до 6,0106 КОЕ/мл после реактивации(индексы деления 600 и 620, соответственно). Таким образом, у ассоциации Биогарантполилактовит-А-5 установлен защитный и реактивирующий эффект при облучении клеток Е.УФ-светом. С практической точки зрения важным является факт установления не только профилактического, но и лечебного действия нативных культур. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования пробиотика Биогарант-полилактовит-А-5 на основе молочнокислых и пропионовокислых бактерий для профилактики и комплексной терапии онкозаболеваний. Таблица 1 Подавление опухолеподобного роста гриба.ассоциацией, составленной из индивидуальных культур молочнокислых и пропионовокислых бактерий в равных соотношениях Варианты ассоциации Процент снижения числа вторичных колоний под воздействием различных концентраций ассоциаций 2 5 100 100 95 99 85 94 97 100 94 99 Таблица 2 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с ассоциацией Биогарант-полилактовит-А-5 в культуре клеток 2 Препарат Таблица 3 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с ассоциация Биогарант-полилактовит-А-5 в культуре клетокПрепарат Ассоциация Биогарантполилактовит-А-5 Таблица 4 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с ассоциация Биогарант-полилактовит-А-5 в культуре клеток Н 9 Препарат Таблица 5 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с доксорубицином в культуре клеток 2 Препарат Таблица 6 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с доксорубицином в культуре клетокПрепарат Таблица 7 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с доксорубицином в культуре клеток Н 9 Препарат Таблица 8 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с циклофосфамидом в культуре клеток 2 Препарат Таблица 9 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с 5-фторурацилом в культуре клетокПрепарат Таблица 10 Процент выживших клеток через 72 часа инкубации с 5 фторурацилом в культуре клеток Н 9 Препарат Таблица 11 Противолучевая активность молочнокислых и пропионовокислых бактерий Варианты Титры ., КОЕ/мл, после облучения в жидкой среде с различным содержанием культуры пробиотических бактерий 2 2,1108 2,9109 5,0104 Таблица - 12 Реактивирующая активность молочнокислых и пропионовокистых бактерий после облучения Варианты Титры КОЕ/мл, после облучения и реактивации с различным содержанием культуры пробиотических бактерий Индекс деления . после облучения и реактивации с различным содержанием пробиотических бактерий 2 600 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Средство для профилактики и комплексной терапии онкозаболеваний, включающее культуры микроорганизмов, отличающееся тем, что оно содержит молочнокислые бактерии, при их следующем соотношении, мас.-10 КОЕ/г-30-33 пищевые волокна ГОСТ 9164-002-11866470-94