Штамм Clodasporium gossypiicola Cl. 10, обладающий фунгицидными свойствами против возбудителей корневой гнили ячменя и целлюлазной активностью в почве

(51) 12 1/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН. 10, который может быть использован для получения биопрепарата для защиты ячменя от возбудителей корневых гнилей или в качестве эталона при определении целлюлазнои активности других микроорганизмов. Штамм. 10 выделен из ризосферы люцерны Кокше и предназначен для использования в сельском хозяйстве в борьбе с возбудителями корневой гнили в посевах ячменя. Штамм. 10 обладает высокой антагонистической активностью против возбудителей корневых гнилей и альтернариоза семян зерновых культур. Скорость разложения льняного полота на 30 сутки составляет 53, а на 60 сутки достигает 80. Для штамма С. 10 характерна высокая биологическая эффективность против корневых гнилей ячменя, к фазе полной спелости ячменя этот показатель составляет 17,8-51,6. Применение отмеченного штамма в полевых условиях увеличивает урожайность ячменя на 19,8-20,5. Штамм депонирован в РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК под регистрационным номером - 0361.(72) Науанова Айнаш Пахуашовна Айдаркулова Рая Садуахасовна Бисенов Жанабил Алдабергенович Жмабек Баытбек Жетбайызы Назкен Ишмуханбетова Гульзира Нурмагамбетовна Кошаева Айжан Сагидуловна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина. 10, ОБЛАДАЮЩИЙ ФУНГИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОРНЕВОЙ ГНИЛИ ЯЧМЕНЯ И ЦЕЛЛЮЛАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ПОЧВЕ(57) Штамм. 10,обладающий фунгицидными свойствами против возбудителей корневой гнили ячменя и целлюлазнои активностью в почве Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается нового штамма Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается нового штамма. 10, который может быть использован для получения биопрепарата для защиты ячменя от возбудителей корневых гнилей или в качестве эталона при определении целлюлазной активности других микроорганизмов. В настоящее время из-за нарушения агротехники и неразумного применения химических мелиорантов в сельском хозяйстве наблюдается тенденция усиления развития фитопатогенных грибов. В экологически неблагополучных регионах Казахстана все чаще отмечается рост числа заболеваний растений за счет грибов факультативных паразитов, сапрофитов, ранее не являющихся фитопатогенными. Интенсивное развитие микроорганизмов-фитопатогенов приводит к значительным потерям урожайности культур. Существует много различных способов защиты растений от фитопатогенов, но все большее предпочтение отдается биологическим способам борьбы, являющимся безопасными для окружающей среды и человека Смирнова И.Э., Саубенова М.Г.,Олейникова Е.А. Влияние физических факторов на антагонистическую активность целлюлолитических бактерий // Биотехнология. Теория и практика. 2004. -2. - с.26-29. Применение биологического метода защиты растений - экологически выгодный способ интенсификации сельскохозяйственного производства,так как позволяет снижать численность популяции патогенных видов микроорганизмов с минимальными нарушениями структуры биоценоза. В борьбе с грибными болезнями зерновых культур перспективно использование грибов - антагонистов. Они снижают пораженность растений болезнями, стимулируют рост и развитие, увеличивают урожайность, не загрязняют окружающую среду. Известны штаммыТ.Б. Кустова А.И., Петрухина М.Т., Воронкова Е.Н.,Сугоняева Э.К., Федосова Э.П., Софиенко И.А. и др. Штамм гриба-2477, используемый для защиты растений огурца от аскохитоза. А.с.1124473 от 30.03.91, обладающие фунгицидными свойствами против фитопатогенных грибов. Однако эти штаммы не являются антагонистами возбудителей корневой гнили ячменя и не обладают высокой целлюлазной активностью. Указанные штаммы предложены для борьбы с болезнями овощных культур. Известен также штамм. 7,повышающий урожай сельскохозяйственных растений Муромцев Г.С., Маршунова Г.Н., Якоби Л.М. Штамм эндомикоризного гриба. 7,повышающий урожай сельскохозяйственных растений. А.с.1145503 от 15.09.85 путем улучшения фосфорного питания на бедных 2 подвижным фосфором дерново-подзолистых почвах. Недостатком данного штамма является то, что этот штамм не обладает антагонистической активностью против возбудителей корневых гнилей ячменя и предназначен для дерново-подзолистых почв. Технической задачей изобретения является получение нового штамма, обеспечивающего при внесении в почву инокулята повышение урожая зерна, путем снижения распространения корневой гнили в посевах ячменя и повышения целлюлазной активности в почве. Предложен штамм. 10, обладающий фунгицидными свойствами против возбудителей корневой гнили ячменя и целлюлазной активностью в почве с целью получения биопрепаратов в борьбе с болезнями корневой системы. Штамм С.. 10,выделен из ризосферы люцерны Кокше. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов МОН Республики Казахстан под регистрационным номером 0361 и предназначен для использования в сельском хозяйстве в борьбе с возбудителями корневой гнили в посевах ячменя, а также предлагается к использованию в качестве эталона при определении целлюлазной активности других микроорганизмов. В сравнении с известными штаммами имеет следующую характеристику Морфологические и культуральные признаки. На среде Чапека-Докса С.. 10 имеет обильное спороношение,структура рыхлая,плотновойлочная, воздушный мицелий темнооливкового и субстратный мицелий темно-бурого цвета, края колонии ворсистые, обычно диаметром 8-10 мм через 5-6 суток инкубации на среде ЧапекаДокса. Диаметр гифы около 4 мкм в диаметре, с клетками 7,5-26 мк. Длина конидиеносцев 150 мк,ширина 3,5-3,83 мк. Конидии продолговатоэллиптические, в большинстве одноклеточные,размер 4,5-82,7-3,5 мк., базальные конидии 11-15 мк в диаметре цепочки конидий в густых кисточках типа головки, нередко расположенные несколько ярусов в результате пролификации конидиеносцев,редко - одной из базальных конидий. На жидкой среде Чапека-Докса мицелиальная пленка бледно-оливкового цвета, диаметр 40 мм,толщина мицелия 2-3 мм. Физиологические свойства. Штамм является мезофилом, оптимальный интервал температур составляет 23-30 С. Для штамма .. 10 оптимальная кислотность среды находится на уровне рН 5-6. По результатам исследования для роста штамма .. 10 наиболее благоприятными источниками являются аммоний фосфорнокислый,аммоний азотнокислый, аммоний сернокислый и мочевина. Диаметр колоний .. 10 на средах Чапека с различными источниками азота на 7 сутки находился в пределах 10-16 мм. Из источников углерода усваивает Д-лактозу, ксилозу,мальтозу, маннит, где на седьмой день культивирования диаметр колонии достигал 15-26 мм. Умеренный рост у штамма наблюдался на средах с глюкозой. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма Хранение на скошенном агаре под вазелиновым маслом при 3- 4 С. Среда Чапека (г/л) 3 2,0 2 НР 4 - 1,0 4 - 0,5- 0,5 4 следы сахароза - 30 агар-агар - 20,0 дистиллированная вода - 1 л. Стерилизация 120 С 20 мин рН - 6,8 - 7,0. Пересев 1 раз в 3 месяца,инкубация 5 суток при температуре 24-25 С. Лиофильное хранение при температуре не выше 0 С. Способ, условия и состав сред для размножения штамма. Путем пересева кусочка мицелия на агаризованную среду Чапека-Докса,при температуре 25-28 С время культивирования 5-7 суток, затем пересевают на скошенный агар. Условия и состав среды для ферментации. Жидкая среда Чапека-Докса сахароза или глюкоза - 30 г 3 - 2,0 г 2 НРО 4 -1,0 г 472 - 0,5 г- 0,5 г 4 - 0,01 г/л агар-20 г 1 л воды дистиллированной, рН 5-6. Стерилизация 120 С, 20 минут. Пример 1. Изучение интенсивности разложения целлюлозы. Для определения интенсивности разложения целлюлозы была использована тонкая льняная(неотбеленная) ткань. Ткань разрезали на кусочки размером 1015 см и взвешивали. Пришивали ее к полимерной пленке, ширина отрезка пленки 10 см,длина 30 см. Размещали куски ткани один над другим на пленке. Стерилизовали пленки спиртом, а ткань проглаживали горячим утюгом. Для изучения целлюлазнои активности целлюлозоразрушающих грибов была наработана их биомасса. Грибы были культивированы на жидкой среде Чапека в течение 14 дней на роллерной качалке при 220 об/мин. В стерильную почву в сосудах вносили биомассу грибов родаии полотно. Через 30, 45 и 60 суток полотна осторожно извлекали, смывали от почвы и продуктов полураспада, подсушивали и взвешивали. Процент разложения ткани определяли по убыли веса к исходному весу ткани. Для характеристики интенсивности разрушения клетчатки использовали следующую шкалу очень слабая 10 слабая - 10-30 средняя - 30-50 сильная - 50-80 очень сильная - 80. Для сравнения целлюлазнои активности штамма. 10 взяты штаммы целлюлозоразрушающих грибов рода . По результатам исследований целлюлазная активность целлюлозоразрушающих грибов родаив почве была разнокачественной (фигура 1, 2). Наблюдения показали, что за 30 суток целлюлазная активность грибов родаварьировала в пределах 2124, а у грибов рода- 53-83.. . 13 проявил интенсивность разложения льняного полотна. На 45 сутки целлюлазная активность .шт.4 повысилась в 3 раза, ткань разложилась на 69. Однако скорость разложения ткани грибом .. шт. 1 была низкой и соответствовала уровню 30 дней. Гриб . . 10 увеличил активность разложения на 9, а шт. 13, наоборот, снизил активность на 7, по сравнению с результатами,полученными на 30 сутки опыта. Целлюлазная активность грибов родана 60 сутки составила 40-50. Высокая скорость разрушения полотна грибами. . 13 снизилась от 82 до 43. А гриб .. 10 наоборот увеличили скорость разложения от 53 (30 сутки) до 80 (60 сутки). По результатам исследований штаммы .. 10, . 13, .. шт. 1 проявили высокую целлюлазную активность в почве. Пример 2. Антагонистические свойства грибов родапо отношению к основным возбудителям корневых гнилей Антагонистические свойства микромицетов изучены методом агаровых блоков на среде ЧапекаДокса при 28 С. Как показали результаты исследований, все штаммы целлюлозоразрушающих грибов родаобладают высокой антагонистической активностью против фитопатогенов. Наиболее сильным штаммом является С,. 10 Подавление роста возбудителей корневых гнилей и альтернариоза семян целлюлозоразрушающими грибами родаШтамм Из всех патогенных грибов наибольшее угнетение испытывал . . Рост грибов 3 воздействием целлюлозоразрушающих грибов рода(фигура 3, 4,5). Можно выделить три типа проявления антагонистических взаимоотношений. Первый конкуренция за источники питания. Быстрорастущие организмы интенсивнее потребляют субстрат и ограничивают тем самым рост других,нуждающихся в тех же источниках питания. Второй- подавление роста за счет образования токсических веществ неспецифического действия, например органических кислот, сероводорода и др. Третий антагонизм, проявляющийся через образование специфических веществ - антибиотиков. Результаты исследований показали,что целлюлозоразрушающие грибы родовотносятся к третьему типу антагонизма по отношению к возбудителям корневых гнилей зерновых культур. Пример 3. Определение распространения и развития корневой гнили в посевах ячменя,инокулированной целлюлозолитическими грибами рода . Проведены полевые опыты по определению влияния целлюлозоразрушающих грибов на рост и развитие ячменя при разложении растительных остатков. Для создания инфекционного фона были культивированы целлюлозоразрушающие грибы на жидкой питательной среде Чапека-Докса и получена биомасса 500 г каждого штамма. Для испытания микробиологических грибов,разлагающих целлюлозу, был заложен микроделяночный опыт. По заранее составленной схеме опыта был выбран участок, установлена величина и форма делянок. В целях избежания одностороннего взаимного влияния, варианты в опыте размещались методом рендомизированных повторений(случайных блоков). Проведена подготовка семян ячменя к посеву (сортировка и очистка от сорной примеси). Суспензию микроорганизмов ввели путем полива почвы под семенами. В результате фенологического наблюдения за ростом и развитием ячменя отмечена фаза начала всходов - 5 июня, фаза полных всходов - 12 июня. Полевая всхожесть определялась в фазу полных всходов. Инокуляция семян штаммамишт. 10 ишт.1 способствовала увеличению полевой всхожести в среднем на 2,6-3,9. При использовании этих же штаммов для инокуляции семян в опыте с добавлением соломы, показатель всхожести повышался на 4,0-7,3, по сравнению с контролем без соломы. Результаты структурного анализа показали, что целлюлозоразрушающие грибы в большей степени положительно влияют на сохранность растений,число зерен в колосе. Урожайность ячменя в зависимости от использования штаммовиварьировала в пределах от 348,4 до 392,3 г/м 2 на вариантах без соломы, и в пределах 392,4-432,2 г/м 2 на вариантах с соломой(таблица 2). Таблица 2 Структурный анализ урожая ячменя сорта Астана 2007, инокулированной целлюлозоразрушающими грибами, 2010 г. Кол-во Число зерен Масса 1000 колосков в в главном семян, г главном колосе, шт. колосе Как известно, продуктивная кустистость при сравнительно равных агротехнических условиях роста и развития растений в сильной степени зависит от количества растений на единице площади. В результате анализа элементов структуры урожая ячменя выявлено, что продуктивная кустистость на вариантах с применением 4 целлюлозолитических грибов превышала контроль(1,6) на 0,1-0,3 на вариантах без соломы, тогда как на вариантах с применением соломы наблюдалось увеличение этого показателя, как на контроле, так и с наличием грибов родовина 0,1-0,4 шт. Между числом колосков и числом зерен в колосе существует прямая зависимость. Чем больше число колосков, тем выше озерненность колоса. Показатель количества колосков в колосе на всех опытных вариантах без соломы превышал контроль(19,4 шт/колос) на 1,0-1,1 шт/колос, а на вариантах с соломой - на 0,7-2,0 (контроль - 23,0). Число зерен в колосе по вариантам без соломы варьировало от 20,3 до 20,7 шт/колос, тогда как на вариантах с соломой - в пределах 21,9-22,3 г/колос. На варианте с применением соломы масса 1000 семян превалировала над контролем на 1,5-2,3, где этот показатель составлял 51,9 г. Максимальный уровень урожайности наблюдался на вариантах с применением штамма С. 10 без соломы и с применением соломы- 392,3 г/м 2 и 432,2 г/м 2 соответственно. Прибавка урожая на варианте с применением этого штамма по вариантам составила 65,0 и 73,8 г/м 2 соответственно. Пример 4. Определение распространения и развития корневой гнили в посевах ячменя,инокулированной целлюлозолитическими грибами рода . Для оценки состояния больного растения необходимо иметь четкое представление о распространенности(частоте встречаемости) болезни, интенсивности (или степени) поражения растений и о развитии болезни. Распространенность и интенсивность поражения растений характеризует степень устойчивости сортов к болезням. Процент пораженных растений показывает частоту встречаемости болезни на растениях данного сорта. Интенсивность размножения патогена в больных растениях также указывает на восприимчивость или устойчивость хозяина Танский В.И. и др. Экологический мониторинг и методы совершенствования защиты зерновых культур от вредителей, болезней и сорняков. Методические рекомендации. Санкт - Петербург, 2002. - с. 76. В задачи исследований входило выявление и учет развития корневой гнили в течение вегетационного периода в посевах ячменя,инокулированнои целлюлозолитическими грибами Распространение и развитие корневых гнилей в посевах ячменя,инокулированного целлюлозоразрушающими грибами, 2010 Вариант К уборке урожая распространение болезни по вариантам без соломы варьировало от 26,4 до 41,4, а на вариантах с соломой - 14,4-18,3. Развитие болезни в фазу полной спелости снизилась по вариантам без соломы на 64,5 , а с соломой 80,4, по сравнению с этими показателями в фазу кущения. Несмотря на высокие показатели распространения и развития корневой гнили на вариантах с соломой в фазу кущения, к моменту уборки урожая пораженность растений ячменя этой болезнью существенно снизилась, по сравнению с вариантом без соломы. Это можно объяснить тем, что в начале вегетации внесение соломы стимулировало рост патогенных грибов. Однако при одновременном высеве в почву с соломой грибов родовисоздались благоприятные условия для роста и развития растений, так как целлюлозоразрушающие грибы,обладают антагонистической активностью против ряда микромицетов, вызывающих заболевания растений. Наиболее высокая биологическая эффективность против корневых гнилей ячменя выявлена на участках с соломой, где семена были обработаны штаммами С. 10 ишт.1 (таблица 4). Таблица 4 Биологическая и хозяйственная эффективность использования целлюлозоразрушающих грибов против корневой гнили в посевах ячменя Вариант Биологическая эффективность против корневых гнилей обработки семян 10 была самой высокой, соответственно - 17,8 и 51,6. Хозяйственная эффективность использования целлюлозоразрушающих грибов была выше на варианте с применением соломы. В целом, высокая биологическая и хозяйственная эффективность применения целлюлозоразрушающих грибов в посевах ячменя против развития корневой гнили предполагает в дальнейшем использование этих штаммов для изготовления биопрепаратов с высокой антагонистической и ростстимулирующей активностью в целях повышения урожайности зерновых культур плодородия почвы Северного Казахстана. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм. 10,депонированный в РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК, под регистрационным номером 0361,используемый для получения биопрепарата для защиты ячменя от возбудителей корневых гнилей, а также в качестве эталона при определении и целлюлазной активности других микроорганизмов.