Штамм Chaetomium spirochaete Ch. 4, используемый для получения биопрепарата для приготовления компостных удобрений на основе растительных остатков

(51) 12 1/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Штамм. 4 предназначен для приготовления компостных удобрений на основе растительных остатков. Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается нового штамма. 4, который может быть использован в получении биопрепарата для приготовления компостных удобрений на основе растительных остатков. Штамм .. 4 выделен из ризосферы люцерны Кокше и предложен с целью создания биопрепаратов для приготовления компостных удобрений. Штамм .. 4 обладает высокой целлюлазной активностью в почве и активно разлагает растительные остатки зерновых культур. Штамм депонирован в РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК под регистрационным номером 0362.(72) Науанова Айнаш Пахуашовна Бисенов Жанабил Алдабергенович Айдаркулова Рая Садуахасовна Жмабек Баытбек Жетбайызы Назкен Ишмуханбетова Гульзира Нурмагамбетовна Кошаева Айжан Сагидуловна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина. 4, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОМПОСТНЫХ УДОБРЕНИЙ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОСТАТКОВ Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается нового штамма. 4, который может быть использован в получении биопрепарата для приготовления компостных удобрений на основе растительных остатков. В настоящее время совершенно очевидны важность и актуальность исследований в области биоконверсии многочисленных сельскохозяйственных отходов. Основная проблема, связанная с утилизацией целлюлозы, состоит в том, что целлюлоза - устойчивый к различным воздействиям структурный компонент растений. Устойчивость ее обеспечивается другим структурным компонентом лигнином. Поэтому одна из основных задач современной биотехнологии научиться использовать это труднометаболизируемое, но широко распространенное в природе органическое соединение более эффективным способом, чем сжигание. Из целлюлозосодержащего сырья наиболее приемлемыми для этой цели являются отходы сельского хозяйства - солома, листья и стебли различных растений, кукурузная кочерыжка,подсолнечная лузга, багасса, отходы пищевых производств кожура фруктов,отходы картофелеперерабатывающей промышленности,несортовая древесина, опилки, отходы бумажных производств, верховой торф и др. Лобанок А.Г.,Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н., Микробный синтез на основе целлюлозы Белок и другие ценные продукты. - М. Наука и техника, 1988. - с.261. Грибы рода- строгие сапрофиты,разлагающие целлюлозу. Некоторые из них обладают как фунгицидной,так и ростактивирующей активностью в отношении многих растений, что обусловлено выделением антибиотиков и других метаболитов, улучшающих гумусный слой почвы и повышающих ее плодородие Штерншис М.В., Джалилов Ф.С.-У.,Андреева И.В., Томилова О.Г. Биологическая защита растений. - М. Колос. С, 2004. - с.264. Известен способ разложения древесины,сущность которого заключается в том, что с разлагающихся в естественных условиях и компостах древесных остатков на среде Имшенецкого с целлюлозой выделяют ассоциации микроорганизмов, поселяющихся на древесине в почве, и готовят накопительную культуру микробной закваски Свиридова О.В., Туев Н.А.,Сакулина Г.Г., Преображенский К.И. А.с.1792974 от 07.02.93. Недостатком данного способа является то, что в состав микробной закваски входят несколько групп целлюлозоразлагающих микроорганизмов, , , не известен видовой состав данных микроорганизмов, не определено количественное соотношение каждого микроорганизма в закваске,из-за большого количества микроорганизмов очень сложно создавать такую микробную закваску. Технической задачей изобретения является получение нового штамма, обеспечивающего разложение растительных остатков для приготовления компостных удобрений. Предложен штамм .. 4,обладающий целлюлазной активностью в почве с целью получения биопрепаратов для приготовления компостных удобрений. Штамм .. 4 выделен из ризосферы люцерны Кокше. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов МОН Республики Казахстан под регистрационным номером 0362 и предназначен для использования в качестве эталона при определении целлюлазной активности других микроорганизмов и для создания биопрепаратов. В сравнении с известными штаммами имеет следующую характеристику Морфологические и культуральные признаки. На среде Чапека-Докса у штамма . 4 перитеции темно-коричневые, эллипсоидные, 250-320225-280 мкм, с узким устьицем, с ризоидами. Терминальные придатки в основании прямые,затем сильно волнистые и свернутые в спираль с 810 оборотами, диаметр которых 25-30 мкм. Придатки в нижней части 4-5 мкм толщиной,шиповатые, темно-коричневые, с заметными перегородками. Латеральные придатки простые, в нижней части перитеция прямые, сравнительно короткие, ближе к верхушке перитеция они становятся более длинными и незаметно сливаются с вершинными придатками эти придатки у основания 3,5-4,0 мкм толщиной, шиповатые, коричневые. Споры уплощенные с выпуклой и вогнутой сторонами,с плоской стороны широкоэллиптические, заостренные на обоих концах, 8,8-10,58,0-8,5 мкм. На жидкой среде Чапека-Докса мицелиальная пленка белого цвета с желтым оттенком, диаметр 60 мм, толщина мицелия 2-3 мм. Физиологические свойства. Из источников углерода усваивает мальтозу, глюкозу, сахарозу,рамнозу, маннит, ксилозу. Плохо осваивает Длактозу, при росте гриба на питательной среде с добавлением Д-лактозы колонии имели слабый рост. Из источников азота использует аммоний фосфорнокислый, аммоний азотнокислый, аммоний сернокислый и мочевина, за исключением молибденовокислого аммония. Штамм является мезофилом, оптимальный интервал температур составлет 23-30 С. Для штамма .. 4 оптимальная кислотность среды находится на уровне рН 6-8. Штамм .. 4 обладает высокой целлюлозолитической активностью. Протеолитическая активность в большей степени проявляется при разжижении желатины, чем при коагуляции молока. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма. Хранение на скошенном агаре под вазелиновым маслом при 3 - 4 С. Среда Чапека-Докса (г/л) 3 - 2,0 24 - 1,0 4 - 0,5- 0,5 4 - следы сахароза - 30 агар - агар - 20,0 дистиллированная вода - 1 л. Стерилизация 120 С 20 мин рН - 5,5-6,0. Пересев 1 раз в 3 месяца,инкубация 7 суток при температуре 24-25 С. Лиофильное хранение при температуре не выше 0 С. Способ, условия и состав сред для размножения штамма. Путем пересева кусочка мицелия на агаризованную среду Чапека-Докса,при температуре 28 С время культивирования 5-7 суток, затем пересевают на скошенный агар. Пример 1. Интенсивность разложения целлюлозы устанавливают модифицированным аппликационным методом. Для определения интенсивности разложения целлюлозы была использована тонкая льняная (неотбеленная) ткань. Ткань разрезали на кусочки размером 1015 см и взвешивали. Пришивали ее к полимерной пленке,ширина отрезка пленки 10 см, длина 30 см. Размещали куски ткани один над другим на пленке. Стерилизовали пленки спиртом,а ткань проглаживали горячим утюгом. Для изучения целлюлазной активности целлюлозоразрушающих грибов была наработана их биомасса. Грибы были культивированы на жидкой среде Чапека в течение 14 дней на роллерной качалке при 220 об/мин. В стерильную почву в сосудах вносили биомассу грибов родаи полотно. Через 30, 45 и 60 суток полотна осторожно извлекали, смывали от почвы и продуктов полураспада, подсушивали и взвешивали. Процент разложения ткани определяли по убыли веса к исходному весу ткани. По результатам исследований целлюлазная активность целлюлозоразрушающих грибовв почве была разнокачественной(фигура 1). Наблюдения за 30 сутки целлюлазная активность грибов родаварьировала в пределах 2125. На 45 сутки целлюлазная активность .. 3 и ..4 повысилась в 3-4 раза, ткань разложилась на 70-93. .. 3 к этому времени показал наибольшую целлюлазную активность. Однако скорость разложения ткани грибом .. 1 была низкой и соответствовала уровню 30 дней... 4 обладает высокой целлюлазной активностью в почве. На 45 сутки активность разложения целлюлозы составила 70,на 60 сутки - 50. Пример 2. Для изучения роста и развития целлюлозоразрушающих грибов родана различных субстратах была использована солома сельскохозяйственных культур, таких как мягкая пшеница, ячмень, овес и стручки масличной культуры рапса. Контролем служила фильтровальная бумага. В опыте растительные остатки были введены в голодный агар в количестве 2 г, 4 г и 6 г на 100 мл среды. На шестые сутки культивирования были описаны культурально морфологические признаки роста и развития целлюлозоразрушающих грибов, а после 30 суток взвешивали остаточный вес внесенных растительных остатков. В результате исследований скорость роста грибов на различных субстратах и культуральноморфологические признаки были различными,однако на всех испытуемых вариантах наблюдалась закономерность чем больше было внесено растительных остатков в питательную среду, тем лучше развивались грибы (таблица 1). Рост грибовна фильтровальной бумаге, используемой в качестве контроля, по сравнению с развитием на средах с растительными остатками был слабым. Несмотря на редкий мицелий грибы родавсе же образовывали споры, диаметр колоний составлял 14,3-17,9 мм. На растительных остатках ячменя цвет колонийвоздушный мицелий беловатожелтого цвета, диаметр колоний составлял 28-35 мм. Таблица Рост и развитие грибов родана различных растительных остатках сельскохозяйственных культур Диаметр колоний микромицетов на голодном агаре с различным количеством внесенных растительных остатков, мм 2 г 4 г 6 г Фильтровальная бумага (контроль) 17,90,69 16,40,76 15,20,62 16,80,62 15,00,72 14,30,66 16,71,17 15,51,05 14,71,03 Ячмень 34,40,94 35,60,33 33,40,68 32,51,10 36,40,84 28,61,01 34,01,13 28,61,01 30,01,13 Овес 34,91,38 35,80,66 33,52,04 30,81,30 36,80,66 34,01,13 34,01,13 28,80,66 30,01,13 Мягкая пшеница 28,41,3 28,91,13 32,30,92 27,80,96 27,5 Л 1,13 32,60,93 При использовании соломы овса воздушный мицелий штаммовизменялся от белого до серого в зависимости от количества внесенных остатков. Диаметр колоний составлял 28,6-36,4 мм. На соломе из мягкой пшеницы грибы родапоказали слабый рост, мицелиальный газон был редкий. Размеры колоний составили 27,533,3 мм. Спороношение было поздним. Грибы рода на среде с измельченными стручками рапса показали хороший рост. Воздушный мицелий колоний грибов родабелого цвета. На колониях наблюдались звездообразные отпечатки вторичного роста. Спороношение было обильным. Как показали результаты исследований, цвет колоний и интенсивность развития целлюлозоразрушающих грибов изменялись от вида используемых растительных остатков,что объясняется различным химическим составом растений (фигура 2). По интенсивности использования растительных остатков все штаммы грибов родапоказали высокую активность разложения соломы ячменя и рапса (фигура 3). Штамм . . 1 показал высокую степень разложения на всех вариантах, кроме контроля. Особенно высокой целлюлазная активность была на ячмене и рапсе, где разложение увеличивалось от 70 до 97. Солому овса и мягкой пшеницы использовали в пределах 80-87.. . 3 разлагал растительные остатки всех культур на 78-88, кроме рапса, где степень разложения достигала 86-95. Штамм . 4 по использованию соломы ячменя был активнее,чем . . 3, но слабее по сравнению с. . 1, где степень деструкции составляла 90-93. Если на овсе и рапсе этот показатель был на уровне 76-87, то на фильтровальной бумаге целлюлазная активность не превышала 75-81. Солому мягкой пшеницы штамм . 4 разлагал на 81-92. В заключении, интенсивность разложения растительных остатков различных сельскохозяйственных культур грибами родазависит от количества используемых субстратов. Чем больше масса внесенных растительных остатков,тем интенсивнее происходит их разложение. Таким образом, активные штамм .. 4 может быть использован в повышении плодородия почв за счет интенсивной гумификации послеуборочных растительных остатков при нулевой технологии возделывания сельскохозяйственных культур, а также в биоконверсии целлюлозосодержащих материалов в различных отраслях промышленности. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм. 4,депонированный в РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК, под регистрационным номером 0362,используемый для получения биопрепарата для приготовления компостных удобрений на основе растительных остатков.