Способ биоремедиации нефтезагрязненных почв

(51) В 09 С 1/00 (2006.01) В 09 С 1/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ может быть использовано для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов с применением микроорганизмов и применено в нефтехимической и нефтедобывающей промышленности и на объектах хранения нефти и нефтепродуктов. Данный способ сокращает период биоремедиации за счет внесения природных углеводородокисляющих микроорганизмов,органического и минерального удобрений стимулирующих вносимую и аборигенную микрофлору, при этом проводят периодическое рыхление для улучшения воздушного режима почвы. Способ обеспечивает в засушливых климатических условиях восстановление сильнозагрязненной нефтью почвы в течение одного вегетационного периода и может быть использован для восстановления почв нефтепромыслов, территорий нефтехранилищ и нефтеперерабатывающих предприятий.(72) Саданов Аманкелди Курбанович Шорабаев Ерик Жарылкасынович Чукпарова Айгуль Ултараковна Кулжанова Камшат Арыстановна Черемисова Татьяна Генадьевна Кадралиев Адилжан Какимжанович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ 21685 Изобретение относится к биотехнологии и ремедиации нефтезагрязненных почв, которое может быть использовано для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов с применением микроорганизмов и применено в нефтехимической и нефтедобывающей промышленности и на объектах хранения нефти и нефтепродуктов. На фоне кризиса состояния окружающей среды все большее значение приобретают способы биологической очистки нефтезагрязненных земель как наиболее эффективные и экологически безопасные. Большой популярностью пользуются микробные препараты, предлагаемые в широком ассортименте биотехнологическими компаниями Европы, США и Японии и др. Однако, как свидетельствует практика,применение биопрепаратов российского и зарубежного производства на территории казахстанских нефтяных месторождений, расположенных в аридной климатической зоне, характеризующейся высокой засоленностью почвы и малым количеством годовых осадков, как правило,оказывается малоэффективным. Помимо этого неконтролируемое внесение в открытые экосистемы искусственно созданных микробных популяций, не характерных для данных почвенных биоценозов,может представлять значительную опасность для аборигенных микробных сообществ. В регионах с засушливыми климатическими условиями естественные процессы самоочищения и восстановления нефтезагрязненных почв протекают крайне медленно. Поэтому наиболее актуальны приемы очистки почвы с использованием технологии,предусматривающей эффективное разложение нефтяных углеводородов путем внесения в почву природных микроорганизмов. Известен способ очистки нефтезагрязненной почвы с использованием биопрепарата, в состав которого входит суспензия микроорганизмов в концентрации 1.1011-5.1012 клеток/мл, хлорид натрия в количестве 10 и биологически активные вещества (Патент РФ 2114071). Однако недостатком данного способа является высокое содержание в биопрепарате хлорида натрия,а также использование сложных по составу и дорогостоящих биологически активных соединений(витаминов и бетаина). Известен способ промышленного биохимического обезвреживания нефтешлама, который апробирован на территории Первомайской нефтебазы г. Алматы (предприятие Мунай бейс)(Предпатент 15278 РК). После обработки биомассой нефтеокисляющих бактерий содержание углеводородов нефти в искусственной почве составило 0,1 мг/кг. Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ биоремедиации нефтезагрязненных почв путем обработки почвы бакпрепаратами и посев семян бобовых и злаковых культур растений, предварительно обработанных раствором бакпрепаратов,содержащих. 1-96 Аб 3 Т БиофлораВ-05 ВКПМ, некорневой 2 подкормкой вегетирующих растений минеральными удобрениями. Для обработки почвы используют вышеуказанные препараты с добавлением дополнительных бакпрепаратов,включающихВКПМ В-5987 и консорциум ВКПМ 5972,состоящего из,,. ,,,и использование для роста растений активатора Эль-1 заводского изготовления(патент РФ 2176164). Недостатком указанного способа является обработка семян жидкими бакпрепаратами, что требует немедленного их внесения в почву, так как от длительного хранения они теряют активность. Поэтому бактериальные препараты можно применять только на ближайшем расстоянии от пункта их приготовления, а на большие расстояния жидкие препараты изготовлять не рекомендуется. Кроме того внесение большого количества биопрепаратов (8 видов), а также использование для роста растений активатора Эль-1 заводского изготовления требуются определенные затраты, что удорожает использование данного способа. Задача изобретения - разработка способа биоремедиации загрязненных нефтью почв,предусматривающий использование биопрепарата в виде пасты или порошка, представляющего собой совокупность микроорганизмов-деструкторов на основе цеолита,а также проведение технологических мероприятий (рыхление, внесение органического и минерального удобрения). Техническим результатом настоящего изобретения является сокращение сроков восстановления нефтезагрязненных почв за счет внесения пула углеводородокисляющих микроорганизмов и стимуляции процессов деградации нефтяных углеводородов. Характеристика штамма 69 Штамм 69 выделен из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Штамм представляет собой кокки, одиночные и в парах, 1,25 мкм в диаметре. Не кислотоустойчивые,грамположительные, спор не образуют. На СПА культура образует округлые, выпуклые оранжевого цвета колонии, диаметром 1-2 мм. Край колоний ровный, пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте на СПБ образует придонный рост со скудным осадком. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки Использует маннит и арабинозу с образованием кислоты. Крахмал не гидролизует, желатину не разжижает. Сероводород и индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Обладает уреазной активностью. Растет на СПБ при 7 . Хранят на скошенных агаризованных средах с 1 нефтью или с углеводородом при температуре 4 С. Пересев осуществляют через 3 месяца. 21685 Растет при температуре 1537 С, оптимум температуры роста -2530 С. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 69 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером - 0181. Характеристика штаммаУД 6-4 ШтаммУД 6-4 выделен из образцов нефтезагрязненной почвы, отобранных в Атырауской области. Штамм представляет собой кокки, одиночные и в парах,1,25 мкм. Не кислотоустойчивые,грамположительные, спор не образуют. На СПА культура образует округлые, выпуклые колонии красного цвета, диаметром 1 -2 мм. Край колоний ровный, пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте на СПБ образует придонный рост со скудным осадком. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует глюкозу. Крахмал не гидролизует, желатину не разжижает. Сероводород образует, индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Обладает уреазной активностью. Растет на СПБ при 7 . Хранят на скошенных агаризованных средах с 1 нефтью или с углеводородом при температуре 4 С. Пересев осуществляют через 3 месяца. Растет при температуре 1037 С, оптимум температуры роста -2530 С. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерийУД 6-4 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером - 0180. Характеристика штамма 20 Штамм 20 выделен из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Штамм представляет собой грамположительные палочки с закругленными концами, образует споры эллиптической формы. На СПА культура образует округлые, выпуклые колонии бледно-розового цвета, диаметром 2-3 мм. Край колоний ровный,пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте на СПБ образует пленку,бульон прозрачный со скудным осадком. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует глюкозу и маннозу. Крахмал гидролизует, желатину разжижает. Казеин не гидролизует. Сероводород и индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Обладает уреазной активностью. Растет на СПБ при 7 . Растет при температуре 1537 С, оптимум температуры роста -2530 С. Хранят на скошенных агаризованных средах с 1 нефтью или с углеводородом при температуре 4 С. Пересев осуществляют через 3 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 20 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером 0182. Характеристика штамма 28 Штамм 28 выделен из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Штамм представляет собой грамположительные палочки с закругленными концами, образует споры эллиптической формы. На СПА культура образует округлые, выпуклые колонии розового цвета,диаметром 2-3 мм. Край колоний ровный,пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте на СПБ образует пленку,бульон прозрачный со скудным осадком. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует глюкозу с образованием кислоты. Крахмал и казеин гидролизует, желатину разжижает. Сероводород и индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Растет на молочножелточном солевом агаре, а также при 7. Растет при температуре 1537 С, оптимум температуры роста -2530 С. Хранят на скошенных агаризованных средах с 1 нефтью или с углеводородом при температуре 4 С. Пересев осуществляют через 3 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 28 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером - 0183. Характеристика штаммаДн ШтаммДн выделен из нефтезагрязненной почвы Карагандинской области. Штамм представляет собой подвижные палочки. Грамположительные,не кислотоустойчивые,спорообразующие, споры эллипсоидной формы с центральным расположением. На СПА культура образует округлые, выпуклые бежевого цвета колонии диаметром 3-5 мм. Консистенция мягкая,легко снимается с поверхности агара. Край колоний ровный, пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте на СПБ образуется придонный рост, при встряхивании среды осадок волокнистый,бульон прозрачного цвета. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует лактозу с образованием кислоты. Крахмал гидролизует слабо,желатину разжижает. Сероводород образует, индол не образует. Не восстанавливает нитраты до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Образует рост на СПБ при 6,5 . Растет при температуре 537 С,оптимум температуры роста - 2530 С. 21685 Хранят на скошенных агаризованных средах с 1 нефтью или с углеводородом при температуре 4 С. Пересев осуществляют через 3 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерийДн депонирован в коллекции в Республиканской коллекции микроорганизмов НЦБ РК под номером- 0197. Характеристика штамма 2 Штамм 2 выделен из нефтезагрязненной почвы Карагандинской области. Штамм представляет собой грамотрицательные палочки с закругленными концами. Края колонии на СПА прозрачные по центру непрозрачные бежевого цвета, при солнечном цвете синий оттенок, край колоний ровный, пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте на СПБ образует тонкую пленку, среда мутная однородная, осадок умеренный. Штамм относится к 3-му классу опасности. Физиолого-биохимические признаки Сероводород образует. Нитраты не восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Утилизирует цитрат на среде Симонса. Желатину разжижает, казеин не гидролизует Растет при температуре 1537 С, оптимум температуры роста -2530 С. Хранят на скошенных агаризованных средах с 1 нефтью или с углеводородом при температуре 4 С. Пересев осуществляют через 3 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 2 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером - 0195. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами Пример 1. Почву загрязненную нефтью и нефтепродуктами на подготовленном участке обрабатывали пастообразным препаратом, титр клеток каждого углеводородокисляющего микроорганизма 69 0181 ,УД 6-4 - 0180,20 - 0182,280183 составлял 1015-16 кл/г, в качестве наполнителя использовали цеолит. Перед внесением минерального и органического удобрений с целью однородного распределения углеводородов нефти осуществляли вспахивание почвы. Минеральное и органическое удобрения (нитроаммофоску и навоз),вносили из расчета 40 г нитроаммофоски и 7,5 кг навоза на 1 м 2. Обработку почвы биологическим препаратом проводили дождеванием,после которого осуществляли рыхление для улучшения режима аэрации и сохранения углеводородокисляющих микроорганизмов на почвенных частицах. При этом осуществляли контроль остаточного содержания нефти и микробиологического состояния почвы. Устанавливали начальное содержание нефти в 4 почве, затем через 1,5 и 8 месяцев. Через 1,5 месяца обработанную делянку засевали смесью семян 15 аридных одно- и многолетних растений кохия простертая (.), кохия веничная( -). Морфофизиологические и биометрические обследования посевов проводили в процессе роста и развития растений. Содержание нефти в почве определяли весовым методом после экстракции ее метилен хлоридом. Для изучения динамики численности основных групп микроорганизмов проводили посев почвенной суспензии на соответствующие плотные питательные среды, общую микробную численность выявляли на среде СПА, углеводородокисляющих микроорганизмов - на среде ВорошиловойДиановой с 1 нефтью, актиномицеты и мицелиальные грибы - на среде Чапека. В табл. 1 представлены результаты остаточного содержания нефти в почве загрязненного участка. Исследования показали, что через 1,5 месяца содержание нефти в почве контрольного участка(без внесения удобрений и микроорганизмов) снизилось с 32,68 до 21,15 г/кг почвы, через 8 месяцев остаточное содержание нефти в почве составило 16,92 г/кг. Содержание нефти через 8 месяцев при сравнении с начальным ее содержанием снизилось на 48,22. На опытном участке через 1,5 месяца остаточное содержание нефти в почве составило всего 3,14 г/кг,через 8 месяцев - 1,85 г/кг почвы. Процент деструкции нефти за 8 месяцев составил 94,33. При изучении динамики численности почвенных микроорганизмов отмечено увеличение общей микробной численности, углеводородокисляющих микроорганизмов. Численность зависит от количественного содержания нефти в почве. Массированное нефтяное загрязнение почвы приводит к угнетению численности углеводородокисляющих микроорганизмов, связанное с токсическим эффектом нефти, при обработке нефтезагрязненной почвы биопрепаратом через 1,5 месяца наблюдалось увеличение численности углеводородокисляющих микроорганизмов в 10 раз,общей микробной численности в 4,3 раз. Актиномицеты считаются индикаторам состояния почвы. Так если в фоновой почве их численность достигала 420 тыс. кл/г почвы в нефтезагрязненной почве без обработки их численность практически элиминировалась и составляла всего 2,7-1,4 тыс. кл/г почвы. Численность мицелиальных грибов в нефтезагрязненной почве на опытных участках по сравнению с контролем возросла в 1,5-3,3 раза. 21685 Результаты микробиологического анализа почв приведены в таблице 2. В табл. 3 приведены результаты по количеству всходов посеянных озимых галофитных растений. Следует отметить, что прорастание растений началось с 21 по 30 марта, ветвление с 19 марта по 7 мая. С 12 мая по 17 сентября 2007 г. было минимальное количество осадков, что негативно отразилось на росте многолетних растений. Среди высеянных многолетних культур растений наибольшая всхожесть отмечена у кохии простертой и камфоросмы Монопельской - 210 и 235,7 шт/м 2 соответственно. В целом по опыту отмечается увеличение всхожести всех многолетних культур на опытном участке обработанным консорциумом микроорганизмов. Отмечалось отсутствие роста у таких видов, как карелиния Каспийская, полынь морская, полынь Шренке, сведа высокая, что связано с минимальным количеством осадков. Среди однолетних растений наилучшая всхожесть отмечалась у верблюдки арало-каспийской, кохии веничной и бассии очитковидной - 147,6, 76,6 и 73,6 шт/м 2 соответственно. Оптимальная полнота стояния растений на 1 м 2 не могла не повлиять на продуктивность растений. В травосмеси продуктивность пастбищной массы была сформирована преимущественно лебедой татарской, у которой процент участия в формировании продуктивности составил 87,2. Участие в формировании продуктивности остальных видов однолетних растений составило от 5,6 у бассии очитковидной до 1,3 у верблюдки арало-каспийской (таблица 4). Наилучшую продуктивность пастбищной массы отмечалось на опытном участке с внесением консорциума микроорганизмов, она составила 135,6 ц/га, тогда как на контрольном участке 97,3 ц/га. Помимо этого отмечено увеличение роста и количество стеблей растений, так на опытном участке количество стеблей растений составило 252,9 против 117 шт/м 2 в контроле, а рост растений увеличился в 1,3 раза (табл. 5). Пример 2. Почву загрязненную нефтью и нефтепродуктами на выровненном участке обрабатывали сухим препаратом, титр клеток каждого углеводородокисляющего микроорганизма 69 0181,УД 6-4 - 0180,20 0182,Дн - 0197,2 - 0195 составлял 1012-14 кл/г, в качестве наполнителя использовали цеолит. Обработку нефтезагрязненной почвы вели аналогично примеру 1. Контрольным участком являлась загрязненная нефтью почва без внесения мелиорантов и микроорганизмов. Определение остаточного содержания нефти проводили до внесения препарата и через 2 месяца от начала эксперимента. Содержание нефти в почве определяли весовым методом после экстракции ее метилен хлоридом. Для изучения динамики численности основных групп микроорганизмов проводили посев почвенной суспензии на соответствующие плотные питательные среды, общую микробную численность выявляли на среде СПА, углеводородокисляющих микроорганизмов - на среде ВорошиловойДиановой с 1 нефтью, актиномицеты и мицелиальные грибы - на среде Чапека. Результаты исследования показали, что на опытном участке деструкция нефти составило 62,32, тогда как на контрольном участке - 5,37(табл. 6). При изучении динамики численности почвенных микроорганизмов отмечено увеличение общей микробной численности. При обработке нефтезагрязненной почвы биопрепаратом через 2 месяца наблюдалось увеличение всех групп микроорганизмов (табл. 7). Полученные результаты, представленные в таблице свидетельствуют об улучшении микробиологического состояния почвы на экспериментальном участке, если сравнивать с контролем (загрязненная нефтью почва), то в почве на опытном участке увеличивается общая микробная численность в 7,2 раза, отмечается увеличение численности актиномицетов в 22,8 раза,данная группа почвенных микроорганизмов считается индикатором состояния почвы. Отмечается увеличение углеводородокисляющих микроорганизмов в 2,7 раза, мицелиальных грибов в 6 раз. Увеличение численности мицелиальных грибов связано с участием некоторых представителей данной группы в разложении длиноцепочных углеводородов нефти в почве. Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для биоремедиации нефтезагрязненных почв. Таблица 1 Содержание нефти в процессе рекультивации почв Варианты опыта Контроль Опыт 21685 Таблица 2 Динамика численности микроорганизмов в почве (тыс. кл/г). Варианты опыта Почва незагрязненная Контроль Контроль Опыт Контроль Опыт ОМЧ Актиномицеты Грибы До начала эксперимента 1840,16 4200,75 0,20,16 1660,15 2,730,60 0,830,33 Через 1,5 месяца от начала эксперимента 1450,14 1,070,14 0,70,87 7170,72 20,60,06 1,310,38 Через 8 месяцев от начала эксперимента 620,09 1,40,04 0,330,21 1660,08 51,20,46 2,720,43 Количество всходов посеянных озимых галофитных растений. Вариант Контроль Опыт Вариант Контроль Опыт Количество всходов семян многолетних галофитных растений, (шт/м 2) Кохия Камфоросма Саксаул Чогон Ежовник Буюргун простертая Монопельская черный безлистный 122,7 139,2 0,5 3,5 1,0 1,2 210,0 235,7 4,0 11,7 2,5 3,2 Количество всходов семян однолетних галофитных растений, (шт/м 2) Бассия Кохия КлимаЛебеда Верблюдка Всходы очитковидная веничная коптера татарская аралооднолетних мясистая каспийская растений 45,6 42,3 9,6 26 38 161,5 73,6 76,6 25,6 33,6 147,6 357,0 Таблица 4 Ботанический состав травосмеси Вид однолетних трав Лебеда татарская Бассия очитковидная Кохия веничная Климакоптера мясистая Верблюдка арало-каспийская Варианты опыта Контроль Опыт Содержание остаточной нефти в почве Варианты опыта Контроль Опыт 6 Содержание нефти, г/кг До внесения препарата После внесения препарата 20,576 19,471 7,753 21685 Таблица 7 Динамика численности микроорганизмов в почве (тыс. кл/г). Варианты опыта Почва не загрязненная Контроль Почва не загрязненная Контроль Опыт Общая численность микроорганизмов 1200,000,12 До начала эксперимента Актиномицеты Мицелиальные грибы 7,230,98 6,600,93 85,000,11 4,860,80 0,500,26 Через 2 месяца от начала эксперимента 693,000,96 68,300,95 5,530,85 169,000,15 1 220,000,13 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ биоремедиации нефтезагрязненных почв путем обработки ее нефтеокисляющими микроорганизмами, отличающийся тем, что на загрязненной нефтью почве периодически проводят рыхление и вносят удобрения, при этом титр вносимых в почву микроорганизмов составляет не менее 109 кл/г препарата, в дальнейшем проводят фиторемедиацию - посев аридных галофитных растений.