Способ оценки клубней картофеля на устойчивость к фузариозу

(51) 01 25/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ для оценки клубней картофеля к фузариозу в лабораторных условиях за 7 дней. Для оценки устойчивости клубней картофеля к фузариозу разработана шкала. В полевых условиях оценка полевой устойчивости селекционного материала часто не дает удовлетворительных результатов, так как развитие фузариоза зависит от хранения клубней картофеля. Штаммы, поражающие картофель, могут отсутствовать или появляться лишь в конце вегетационного периода, и поэтому полевая устойчивость будет не такая точная. В связи с этим,в качестве лабораторного метода для определения устойчивости к фузариозу нами разработан способ заражения клубней картофеля высокотоксичным и высокопатогенным штаммом гриба. Для этого необходимо поддерживать стандартные условия влажность и температуру, так как болезнь проявляется на клубнях в период их хранения. Достижения технического результата - оценка сортов, гибридов и форм растений на устойчивость к фузариозу высокопатогенным и высокотоксичным штаммом 1 гриба, что значительно повысит эффективность селекционного процесса на устойчивость к болезням.(72) Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Каримова Венера Конысбаевна Рахимжанова Айжан Осербаевна Магзумова Гульмира Козовна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗУ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству,конкретно к способу оценки картофеля на устойчивость к сухой фузариозной гнили. Задача изобретения - оценка клубней картофеля на устойчивость к фузариозу в лабораторных условиях. Технический результат может быть достигнут при использовании мицелия высокопатогенного и высокотоксичного штамма 1 гриба Изобретение относится к сельскому хозяйству,конкретно к способу оценки картофеля на устойчивость к сухой фузариозной гнили. Фузариоз, или сухая фузариозная гниль - очень распространенная болезнь картофеля. Заболевания вызывают почвенные грибы рода.(. и), которые присутствуют в почвах и могут сохраняться в виде спор в течение многих лет. Гриб . является более распространенным и патогенным. Инфекция заболевания в подавляющем большинстве случаев есть в почве, на клубнях картофеля и с ними заносится в хранилища и бурты. Заболевание распространено повсеместно, является причиной отходов картофеля в течение зимне-весеннего сезона. Потери урожая клубней из-за этого заболевания в период хранения нередко достигают 50. Особенно сильно поражаются сухой гнилью клубни, имеющие механические повреждения. Болезнь проявляется на клубнях в основном в период их хранения и наиболее часто через 2-3 месяца после уборки. Вредоносность сухой фузариозной гнили не исчерпывается отходом клубней при хранении. Также посадочные клубни,пораженные сухой фузариозной гнилью в небольшой степени и высаженные в почву,становятся причиной значительно выпада растений,что приводит к недобору урожая и изреженности посевов. Аналог изобретения. Известен метод оценки устойчивости картофеля к фитофторозу,позволяющий проводить оценку селекционного материала как на начальных этапах развития (фаза всходов), так и на протяжении всего периода вегетации (Попкова К.В. Методы оценки полевой фитофтороустойчивости картофеля. Издательство Колос. 1977. с. 109-115.). Этот метод оценки позволяет отбирать растения картофеля только устойчивые к фитофторозу. С помощью такого метода нельзя отобрать растения, обладающие устойчивостью к фузариозу. Также из аналогичных изобретений известен способ оценки клубней картофеля на устойчивость к фитофторозу Клубни отмывают от почвы,дезинфицируют их поверхность, после чего погружают их на 15 минут в водную суспензию зооспорангиев или зооспор. Затем инокулированные клубни укладывают в деревянные ящики, пересыпая влажными опилками,и покрывают сверху мокрой мешковиной. В таком состоянии клубни инкубируют в течение 2 недель при температуре 15-18 С. О степени устойчивости судят по размерам некротических пятен и интенсивности спороношения, образующегося на поверхности клубней. Недостатком указанного способа является то, что его можно использовать только для фитофтороза и не сразу происходит проникновение зооспор из-за кожуры клубня, в связи с этим анализ на устойчивость не дает точный результат (Шкаликов В.А., Дьяков Ю.Т., Смирнов А.Н. Иммунитет растений. - М. КолосС, 2005. 190 с.) Отличие предлагаемого нами способа заключается в оценке целых клубней сортов картофеля на устойчивость к фузариозу штаммами гриба ,в условиях лаборатории. Задача изобретения - оценка клубней картофеля на устойчивость к фузариозу в лабораторных условиях. Технический результат может быть достигнут при использовании мицелия высокопатогенного и высокотоксичного штамма 1 грибадля оценки клубней картофеля к фузариозу в лабораторных условиях за 7 дней. Для оценки устойчивости клубней картофеля к фузариозу разработана шкала. В полевых условиях оценка полевой устойчивости селекционного материала часто не дает удовлетворительных результатов, так как развитие фузариоза зависит от хранения клубней картофеля. Штаммы, поражающие картофель, могут отсутствовать или появляться лишь в конце вегетационного периода, и поэтому полевая устойчивость будет не такая точная. В связи с этим,в качестве лабораторного метода для определения устойчивости к фузариозу нами разработан способ заражения клубней картофеля высокотоксичным и высокопатогенным штаммом гриба. Для этого необходимо поддерживать стандартные условия освещенность, влажность и температуру,так как болезнь проявляется на клубнях в период их хранения. Достижения технического результата - оценка сортов, гибридов и форм растений на устойчивость к фузариозу высокопатогенным и высокотоксичным штаммом 1 гриба, что значительно повысит эффективность селекционного процесса на устойчивость к болезням. Пример 1. Изучение фитотоксических свойств штаммов 1, 2 грибаИзучена фитотоксичность культуральных фильтратов (КФ) штаммов 1, 2 грибадля оценки сортов, гибридов и форм картофеля высокотоксичным штаммом на устойчивость к фузариозу. Для получения КФ поверхностно культивировали штаммы грибана жидкой среде Чапека. В качестве стандартного теста использовали семена яровой мягкой пшеницы сорта Акмола 2. Как видно из таблицы 1, на рост растений поразному оказали влияние метаболиты КФ штаммов 1, 2 гриба, выращенного на жидкой среде Чапека. КФ штамма 1 гриба .оказал ингибирующее действие на рост ростков и корешков пшеницы. Наибольший рост ростков растений наблюдали на контроле - 510 мг (100),начиная с концентрации 10 до 100 КФ, шло значительное снижение от 54,9 до 3,9 в зависимости от концентрации КФ. Сильное подавление ростков наблюдали при концентрациях КФ 50 - 86 мг, 100 - 20 мг в среднем на одно растение. В проводимом эксперименте средняя масса ростков на одно растение снизилась от 510 мг до 20 мг. Менее существенным было влияние фитотоксичности штамма 2 грибана рост ростков растений. Данный КФ штамма 2 грибапо сравнению со штаммом 1 стимулировал рост ростков растений пшеницы. На концентрации 10 КФ рост проростков составил 131,4 к контролю. Таблица 1 Влияние КФ штаммов грибана проростки растений Концентрация КФ Контроль 10 20 50 100 Контроль 10 20 50 100 Также при 20 КФ не наблюдали подавление роста ростков. Начиная с 50-ной концентрации данного фильтрата средняя масса ростков начала сильно угнетаться до 90 мг в среднем на одно растение. Таким образом,фитотоксическая активность двух штаммов грибабыла различна. Штамм 1 грибасильнее угнетал ростки растений по сравнению со штаммом 2. Также изучен рост корешков растений на различных концентрациях КФ 2-х штаммов гриба. Рост корешков пшеницы сильнее подавлялся по сравнению с ростками при действии КФ двух штаммов. В ходе эксперимента установлено, что КФ штамма 1 грибасильно ингибировали рост корешков, уже начиная с 10 концентрации КФ - 42,1, на концентрации 50 КФ прирост составил 5,3 (20 мг). На концентрации 100 КФ рост корешков прекратился, они бурели и отмирали. Кроме этого, изучено влияние метаболитов штамма 2 грибана корешки пшеницы. При низких концентрациях КФ в водном растворе наблюдали эффект стимулирования роста корней. Наибольшая стимуляция роста корешков выявлена на концентрациях КФ - 10 20. При высоком стимулирующем эффекте на варианте 10 КФ, прирост биомассы корешков составил 152,6 к контролю. На 20 КФ рост корешков соответствовал контролю. Активное подавление роста корешков наблюдали с 50 КФ штамма 2 гриба. Таким образом, установлена различная степень угнетения и токсичности в зависимости от КФ штаммов 1 и 2 гриба. На основании полученных данных показана более высокая степень токсичности штамма 1 по сравнению со штаммом 2, полученный КФ штамма 1 грибасодержал в своем составе более токсичные метаболиты по сравнению со штаммом 2, которые значительно подавляли рост стеблей и корней пшеницы. Для оценки сортов,гибридов и форм картофеля на устойчивость к фузариозу рекомендуем использовать более токсичный КФ штамма 1 гриба Пример 3. Разработка шкалы по определению устойчивости картофеля к сухой фузариозной гнили Для разработки шкалы по определению устойчивости картофеля к сухой фузариозной гнили провели заражение целых клубней картофеля штаммами 1 и 2 гриба. Искусственно заражали целые клубни картофеля,которые предварительно мыли и обсушивали, и в каждом клубне делали разрез диаметром 1010 мм. Клубни инокулировали мицелием штаммов 1, 2 грибаи закрывали отверстие лейкопластырем. Зараженные клубни культивировали в термостате при температуре 26 С и 70-ной относительной влажности воздуха в течение 7 дней. Через 7 дней анализировали клубни по степени зараженности. На основе этого разработали шкалу по оценке устойчивости картофеля к сухой фузариозной гнили 0 - устойчивые. Мицелий отсутствует на клубнях картофеля. 1 - практически устойчивые. Мицелий присутствует на срезе клубнях картофеля, но не проник внутрь клубня. 2 - среднеустойчивые. Клубень поражен на глубину не более 5 мм, при срезе клубня граница распространения инфекции видна в виде темной полосы. 3 средневосприимчивые. Клубень поражен на глубину не более 7 мм, пораженные участки клубня сморщены, покрыт белесыми подушечками, при срезе видны белые пустоты. 4 - сильновосприимчивые. Клубень поражен на глубину более 10 мм, пораженная часть клубня в виде темных концентрических кругов, при срезе клубня мякоть разрушена и выстлана бело-серым мицелием. Пример 2. Изучение патогенности штаммов грибаИсследована фитопатогенность штаммов 1, 2 гриба, вызывающий сухую фузариозную гниль картофеля. Для определения патогенности штаммов грибаиспользованы клубни 6 сортов картофеля. В ходе эксперимента нам очень важно было выбрать высокопатогенный штамм грибадля дальнейшего эффективного использования при оценке клубней картофеля на устойчивость к фузариозу. Для определения фитопатогенности штаммов предварительно искусственно инокулировали мицелием штаммов 1, 2 грибаздоровые клубни сортов картофеля. После культивирования в термостате через 7 дней определили симптомы заболевания и интенсивность их проявления. Провели внешний осмотр клубней картофеля по размерам поражения, очагу заражения,скорости некротизации тканей,наличию складчатости, подушечек спороношения. По срезу клубней картофеля описывали окраску пораженной ткани, ее консистенцию, наличие полостей, мицелия и спороношений в них, границу между гнилой и внешне здоровой тканью. Затем по шкале определили устойчивость клубней к фузариозу. Нами установлено, что штаммы 1, 2 грибаимели различную степень патогенности. Как видно из таблицы 3, штамм 1 более активно поражал клубни сортов картофеля. Длина пораженных участков варьировала от 20 до 28 мм, а ширина - от 20 до 23 мм. При срезе глубина поражения достигала 15 мм. Внешние признаки и признаки поражения на срезе клубня соответствовали симптомами сухой фузариозной гнили. Из анализируемых клубней сортов картофеля Карасайский,Бакша,Акколь были сильновосприимчивыми - 4. Сорта , Тениз,Тохтар показали среднюю восприимчивость - 3. Внешние признаки и признаки поражения на срезе клубня соответствовали симптомам сухой фузариозной гнили. При заражении на поверхности клубня образовались темные пятна в виде концентрических кругов, на поверхности клубня гриб образовывал белые, бело-серые, бело-желтые подушечки в виде скоплений спор гриба. При срезе границу распространения инфекции определяли по темно-коричневой полосе, пораженная часть мякоти клубня становилась сухой, образовались пустоты,заполненные белым, белосерым мицелием. Штамм 1 грибабыл более патогенным к клубням анализируемых сортов картофеля. На основании полученных данных, высокотоксичным и высокопатогенным был штамм 1 гриба, который рекомендуем использовать для оценки сортов, гибридов и форм картофеля на устойчивость к фузариозу. При сравнительном анализе на фитопатогенность, штамм 1 гриба 4 поражал клубни сортов картофеля со слабой интенсивностью по сравнению со штаммом 2(фиг.1). Клубни сортов картофеля Карасайский,были устойчивыми к этому штамму. На срезе клубнях сорта Тохтар наблюдали слабое спороношение в виде белого мицелия, и по шкале относится 1 - практически устойчивый, у сортов Бакша, Тениз глубина поражения составила только 5 мм и при срезе клубня граница между пораженной и здоровой частью была резко выражена в виде темной полосы (2 - среднеустойчивый). Сильно поразился штаммом 2 сорт Акколь, пораженная часть клубня сморщена при срезе граница больной части от здоровой в виде темной полосы и относится к средневосприичивому - 3. Таким образом, при искусственном заражении клубней картофеля штаммами 1, 2 гриба .наблюдали внутривидовую дифференциацию штаммов по степени патогенности. Наиболее активным по интенсивности спороношения был штамм 1 гриба . , который поразил клубни всех изученных сортов картофеля. Штамм 2 был менее патогенным по сравнению со штаммом 1. Для оценки клубней сортов, гибридов и форм картофеля на устойчивость к сухой фузариозной гнили рекомендуем использовать штамм 1 гриба .. Пример 4. Лабораторная оценка клубней растений-регенерантов картофеля на устойчивость к фузариозу Для определения устойчивости к фузариозу использовали способ заражения клубней картофеля высокотоксичным и высокопатогенным штаммом гриба . , вызывающий сухую фузариозную гниль с помощью разработанной шкалы. Для оценки устойчивости к сухой фузариозной гнили искусственно заражали клубни растенийрегенерантов картофеля второго поколения мицелием штамма 1 гриба . . После этого зараженные клубни культивировали в термостате в течение 7 дней, через неделю определяли симптомы заболевания, интенсивность спороношения по разработанной шкале. Оценка степени устойчивости к сухой фузариозной гнили проводилась по скорости распространения мицелия в мякоти клубня картофеля. Степень устойчивости сортов и растенийрегенерантов картофеля определяли глазомерно и по скорости распространения мицелия в мякоти клубня картофеля по разработанной шкале. Проведена оценка исходного и селекционного материала на устойчивость к сухой фузариозной гнили картофеля. В качестве исходного материала использован сорт Карасайский и растениярегенеранты второго поколения, полученные с помощью клеточной селекции, которые были размножены в пленочной теплице. При проведении эксперимента установили, что растения-регенеранты картофеля имели различную степень устойчивости к сухой фузариозной гнили(фиг.2). Как видно из таблицы 3, при заражении штаммом гриба . растений-регенерантов картофеля степень восприимчивости сильно варьировала в зависимости от устойчивости линий. Сильно поразились сорт Карасайский и растения-регенеранты К 4-8, К 4-9, пораженная часть мякоти была покрыта белесо-розовым мицелием, при срезе мякоть клубня разрушена, и граница больной части клубня от здоровой выделена в виде темных полос. Клубень растения-регенеранта К 4-2 средне поражен, поверхность покрыта сухим мицелием белесого цвета, при срезе граница здоровой части от больной мякоти выделена в виде темной полосы(фиг.2). Линии растенийрегенерантов К 4-3, К 4-7 поражены средне-слабо штаммом 1 гриба ., вызывающего сухую фузариозную гниль картофеля. Следовательно,испытанный метод оценки в лабораторных условиях на устойчивость к сухой фузариозной гнили позволил выделить высокоустойчивые растениярегенеранты - К 4-3, К 4-7. Таблица 2 Оценка устойчивости регенерантов картофеля к фузариозу Линии Штамм 1 Клубень сильно поражен, пораженная часть мякоти клубня покрыта белесо 4 розовым мицелием, пораженная часть поверхности клубня темносильновоспри коричневого цвета, при срезе переход поражения в виде темной полосы ичивый Клубень средне поражен, покрыт сухим мицелием белого цвета, края 3 поверхности поражения в виде темного круга, при срезе граница в виде средневоспри темной полосы ичивый Клубень средне-слабо поражен, покрыт белорозовым мицелием, при срезе 2 граница в виде темного круга среднеустойч ивый Клубень средне-слабо поражен, покрыт мицелием белесого цвета 2 среднеустойч ивый Клубень сильно поражен, покрыт сверху сухим бело-серым мицелием, при 4 срезе мякоть поражения бело-желтого цвета. сильновоспри ичивый Клубень сильно поражен, покрыт сверху белосерым мицелием, при срезе 4 мякоть поражения в виде бело-серого цвета сильновоспри ичивый Таким образом, в селекции рекомендуем использовать оценку растений- регенерантов картофеля к сухой фузариозной гнили Опделение фитопатогенных свойств штаммов гриба .на клубнях картофеля Сорт Очаг поражения Штамм 1 Поверхность клубня покрыта серовато-белыми подушечками, при срезе граница клубня выделена в виде темных кругов Пораженные участки клубня темные, при срезе граница распространения инфекции выделена темными штрихами, при срезе видны белые пустоты Пораженные части клубня сморщены, покрыт белыми подушечками Клубень покрыт темными пятнами,при срезе клубня видна гнилая,бело-серая ткань Очаг Шкала, в поражения баллах Штамм 2 Мицелий отсутствует 0 на клубнях картофеля устойчивы й Клубень поражен, при 2 срезе граница среднеусто распространен ия йчивый инфекции в виде темной полосы Клубень при срезе 1 покрыт белесым практичес мицелием, но не ки проник внутрь устойчивы й Клубень не поражен. 0 Мицелий отсутствует устойчивы на клубнях й Клубень поражен при Штамм 1 концентрических кругов, покрыт бело-серым мицелием, при срезе мякоть разрушена и выстлана белосерым мицелием Клубень поражен в виде темных кругов, при срезе мякоть клубня разрушена и выстлана бело-серым мицелием ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ оценки клубней картофеля, включающий отмывание почвы и дезинфекцию поверхностей Пораженная часть 3 клубня сморщена при средневос срезе граница в виде приичивы темной полосы й клубней, отличающийся тем, что устойчивость к фузариозу проводят высокопатогенным и высокотоксичным штаммом 1 грибав лабораторных условиях. Очаг Шкала, в поражения баллах Штамм 2 срезе граница в виде среднеусто темной полосы йчивый