Ассоциированная вакцина против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота

(51) 61 39/08 (2010.01) 61 31/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ высокоиммуногенной, стабильной, не реактогенной вакцины, создающий напряженный иммунитет против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Ассоциированная вакцина включающая инактивированный формалином антиген-15 и адьювант, дополнительно содержит инактивированные формалином антигены 34 В-0132, и 1098 В-0133, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29-31 антиген из штамма 34 В-0132(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29-31 антиген из штамма 1098 В-0133(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29-31 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4-0,6 гель гидрата окиси алюминия(72) Горелов Юрий Михайлович Сущих Владислава Юрьевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины КАРАСАН против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и овец (жидкая и сухая). Алматы КазНИВИ,1998, с. 26(54) АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БРАДЗОТА, ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ОТЕКА И ЭМФИЗЕМАТОЗНОГО КАРБУНКУЛА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой инактивированную ассоциированную вакцину против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении, 25250 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой инактивированную ассоциированную вакцину против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Известна концентрированная гидроокисьалюминиевая формолвакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и овец, содержащая инактивированный антиген из штамма .-15,формалин и раствор геля гидрата окиси алюминия(Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины КАРАСАН против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и овец (жидкая и сухая). Алматы КазНИВИ,1998. - 26 с). Недостатком данной вакцины является то, что она не имеет в своем составе антигеновинеобходимых для высокой иммунологической активности препарата. Задачей изобретения является разработка инактивированной ассоциированной вакцины против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота, которая создавала бы напряженный иммунитет при введении ее в организм животного и не обладала бы реактогенными свойствами. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении,высокоиммуногенной, стабильной, не реактогенной вакцины, создающий напряженный иммунитет против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Инактивированная ассоциированная вакцина против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота включающая инактивированный формалином антиген-15 и адьювант,дополнительно содержит инактивированные формалином антигены 34 В-0132 и 1098 В-0133 при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29-31 антиген из штамма 34 В-0132(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29-31 антиген из штамма 1098 В-0133(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29-31 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4-0,6 гель гидрата окиси алюминия-0133 депонированы в лаборатории по изучению генофонда культур микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Идентификацию штаммов культур-15 и-входящих в вакцину, проводят по основным биологическим свойствам(морфологическим,культуральным,биохимическим), согласно определителю бактерий, ,2009,3,,, 1.1. . - 10671082 . Штаммы характеризуются следующими признаками. Штамм-15 -0131 Морфологические свойства. Штамм-15 В-0131 обладает морфологическими признаками характерными для возбудителя эмфизематозного карбункула крупного рогатого.-15 В-0131 представляют собой подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами. Культуральные свойства. Штамм-15 В-0131 растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 3738 С, с обильным газообразованием, сбраживает галактозу, сахарозу, глюкозу, левулезу, лактозу,разжижает желатину, не образует сероводород и индол. Спорообразование. Штамм-15 В-0131 образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Капсул штамм-15 В-0131 не образует. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигена-15 В-0131 образуются специфические агглютинины в титрах 132-164.-15 В-0131 вызывает гибель морских свинок в дозе 0,4 см 3. Реактогенность. Культура-15 В-0131, введенная подкожно морским свинкам,кроликам в объеме 0,2 см 3 вызывает воспалительную реакцию на месте введения с повышением местной температуры на 0,5-1,0 С и значительным отеком, а на 2-3 сутки вызывает некроз тканей, гибель животных наступает через 3-4 сутки. Иммуногенность. Морские свинки после введения инактивированного антигена,полученного из разрушенных клеток штамма-15 В-0131 в дозе 0,5 см 3 в 6568 случаях приобретают устойчивость к заражению 48-часовой культурой-15 В-0131, введенной в дозе 0,2 см в мышцы задней конечности. Инактивированный антиген, полученный из штамма Штамм-15 В-0131 при двукратном введении в дозе 3,0-5,0 см 3 крупному рогатому скоту обуславливает напряженный иммунитет у 75-85, с образованием агглютининов в титрах 116-1128. Реверсабельность. Штамм морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма-15 В-0131 стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штамм-15 В-0131 отобран нами по интенсивности роста на бактериологических средах и способности накапливать большое количество бактериальной массы. Штамм 34 В-0132 Морфологические свойства. Штамм 34 В-0132 обладает морфологическими признаками характерными для возбудителя злокачественного отека животных. Штамм 34 В-0132 слабо подвижные грамотрицательные палочки со слегка закругленными концами. Культуральные свойства. Штамм 34 В-0132 растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 37 С, образуя равномерную муть и газы, сбраживает глюкозу, глицирин и мальтозу, не образует сероводород и индол. Спорообразование. Штамм 34 В-0132 образует большие овальные споры располагающиеся субтерминально и центрально. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигена 34 В-0132 образуются специфические агглютинины в титрах 18-1 16. Вирулентность. 24-часовая культура штамма 34 В-0132 вызывает гибель морских свинок в дозе 0,1-0,5 см 3. Реактогенность. Культура 34 В-0132, введенная подкожно морским свинкам, кроликам в объеме 0,1-0,5 см 3 вызывает воспалительную реакцию на месте введения с повышением местной температуры на 0,5-1,0 С,значительным отеком и вызывает некроз тканей,гибель животных наступает через 12-36 часов. Иммуногенность. Морские свинки после введения инактивированного антигена, полученного из разрушенных клеток 34 В-0132 в дозе 2,0 см 3 в 70-80 случаях приобретают устойчивость к заражению 24-часовой культурой 34 В-0132, введенной в дозе 0,5 см 3 в мышцы задней конечности. Инактивированный антиген, полученный из штамма 34 В-0132 при двукратном введении в дозе 5,0 см 3 крупному рогатому скоту обуславливает напряженный иммунитет у 80-85, с образованием агглютининов в титрах 116-164. Реверсабельность. Штамм 34 В-0132 по основным культуральным,морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма 34 В-0132 стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 60-90 суток, на среде ГТГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штамм 34 В-0132 отобран нами по интенсивности роста на бактериологических средах и способности накапливать большое количество бактериальной массы. Штамм 1098 В-0133 Морфологические свойства. Штамм 1098 В-0133 обладает морфологическими признаками характерными для возбудителя брадзота и злокачественного отека животных.1098 В-0133 представляют собой подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами. Культуральные свойства. Штамм 1098 В-0133 растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 37-38 С, с обильным газообразованием,сбраживает глюкозу, салицин, левулезу, мальтозу,галактозу, лактозу, разжижает желатину, не образует сероводород и индол. Спорообразование. Штамм 1098 В-0133 образует крупные овальные споры,расположенные центрально или субтерминально. Капсул штамм 1098 В-0133 не образует. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигена 1098 В-0133 образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Вирулентность. 14-28 - часовая культура штамма 1098 В-0133 вызывает гибель морских свинок в дозе 0,3 см 3. Реактогенность. Культура 1098 В-0133, введенная подкожно кроликам в объеме 0,2 см вызывает воспалительную реакцию на месте введения с выпадением шерсти и отеком, гибель животных наступает через 18-24 часа. Иммуногенность. Кролики после введения инактивированного антигена, полученного из разрушенных клеток штамма 1098 В-0133 в дозе 0,5 см в 75-85 случаях приобретают устойчивость к заражению 28 часовой культурой 1098 В-0133, введенной в дозе 0,2 см 3 в мышцы задней конечности. Инактивированный антиген,полученный из штамма 1098 В-0133 при двукратном введении в дозе 3,0 3 5,0 см 3 крупному рогатому скоту обуславливает напряженный иммунитет у 80-88, с образованием агглютининов в титрах 116-164. 1098 В-0133 по основным культуральным, морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма 1098 В-0133 стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 16 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штамм 1098 В-0133 отобран нами по интенсивности роста на бактериологических средах и способности накапливать большое количество бактериальной массы. Изобретение иллюстрируется следующими примерами Пример 1. Питательные среды для культивирования клостридий, их инактивации и концентрирования. Для культивирования клостридий используют мясопептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом и среду панкреотических гидролизатов казеина, вываренного мясного фарша и дрожжей. Для получения антигенов для вакцины пробирки с МППБ под вазелиновым маслом засеянные культурами-15 В-0131,34 В-0132, и 1098 В-0133 помещают в термостат с температурой 37 С и выдерживают 24 часа. После проверки чистоты роста путем микроскопии мазков,культуры - каждую раздельно, высевают во флаконы объемом 0,4 л со средой ПГКМД. Для засева одного флакона используют весь объем суточной культуры,выращенной в двух пробирках. Посевы выдерживают при 37 С 24 часа и вновь проверяют на чистоту и типичность морфологии. Пример 2. Изготовление ассоциированной вакцины против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Полученные культуры используют для засева в бутыли с ПГКМД, в количестве 10-15 от общего объема. Засеянные бутыли помещают на 2-3 суток в термостат при 37 С. Для проверки чистоты и типичности морфологии микробных клеток, выборочно делают мазки и микроскопируют. Чистые культуры с типичной морфологией микроорганизмов в концентрации 2-4 млрд.см 3 с рН 5,5 - 6,5 при температуре 37-39 С обезвреживают формалином, который добавляют в количестве 0,5-0,7 в чистом виде или разведенном до 20 концентрации (пересчет ведут на 40 формальдегид). Формалинизированные культуры выдерживают при температуре 38-42 С в течение 10 суток,периодически перемешивая 2-3 раза в сутки. По истечению указанного срока культуры проверяют на стерильность путем высева на МПБ,МППБ, МПА. Наблюдение за посевами ведут 10 суток, в течение которых они должны оставаться стерильными. В реактор с формалинизированными культурами после установления их стерильности, добавляют стерильный 6 раствор гидрата окиси алюминия(ГОСТ 18287) в количестве 155 к общему объему при рН 4,5-7,0. После добавления гидрата окиси алюминия в реакторы, содержимое хорошо перемешивают и оставляют на 2-5 суток при температуре 12-18 до полного просветления надосадочной жидкости. Отстоявшиеся анакультуры концентрируют путем деконтации надосадочной жидкости в количестве 2/3 объема. Соблюдая правила асептики смешивают оставшиеся части всех трех культур в одном реакторе и нагревают до 423 С и при постоянном перемешивании добавляют стерильный горячий (45-60 С) 2-3 раствор агар-агара или желатины из расчета 50 г сухого вещества на 100 дм 3 вакцины. Вакцину вводили двукратно, с интервалом 20 суток, подкожно в область средней трети шеи в дозе 5,0 мл. Наблюдение за опытными животными вели в течение 12 месяцев. Профилактическую эффективность вакцины проверяли в неблагополучных по брадзоту,злокачественному отеку и эмфизематозному карбункулу хозяйствах Алматинской области. В эксперименте используют 4 группы животных по 50 голов (нетели) в каждой, в которых 3 опытные группы и одна контрольная. Пример 3. Ассоциированную вакцину против брадзота,злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого вводят подкожно при следующем соотношении компонентов антиген из штамма(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29,0 антиген из штамма 34 В-0132(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29,0 антиген из штамма 1098 В-0133(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 29,0 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4 гель гидрата окиси алюминия(6 о раствор) остальное В опытной группе животных (50 голов) через 10 месяцев заболело 6 голов (12). Таким образом,профилактическая эффективность при таком соотношении компонентов составляет 88, а продолжительность иммунитета 6 месяцев. Пример 4. Ассоциированную вакцину против брадзота,злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого вводят также как в примере 3, при следующем соотношении компонентов антиген из штамма(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 30,0 антиген из штамма 34 В-0132(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 30,0 антиген из штамма 1098 В-0133(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 30,0 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,5 гель гидрата окиси алюминия(6 о раствор) остальное В иммунизированной группе животных (50 голов) через 12 месяцев заболело 4 головы (8). Таким образом,профилактическая эффективность вакцины против эмфизематозного карбункула составляет 92, а продолжительность иммунитета составляет 12 месяцев. Пример 5. Ассоциированную вакцину против брадзота,злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого вводят также как в примере 3, при следующем соотношении компонентов антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 31,0 антиген из штамма 34 В-0132(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 31,0 антиген из штамма 1098 В-0133(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 31,0 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,6 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное В опытной группе животных профилактическая эффективность вакцины была такой же, как в примере 5 (92 и продолжительность иммунитета 12 месяцев). В контрольной группе животных (вакцина не применялась) заболело 10 голов (25) животных,причем течение патологического процесса было тяжелее, чем при заболевании в опытных группах. Таким образом,наиболее эффективные результаты иммунизации были достигнуты в примерах 4 и 5, а соотношение компонентов в примере 5 является наиболее оптимальным для серийного выпуска предлагаемой вакцины. Пример 6. Контроль ассоциированной вакцины против брадзота, злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого Физико-химические и биологические свойства Внешний вид, цвет. Слегка опалесцирующая коричневая жидкость с рыхлым сероватым осадком,легко разбивающимся в гомогенную взвесь. Наличие посторонних примесей. Вакцина не должна содержать посторонних примесей, плесени,не разбивающихся конгломератов. Показатель рН (водородных ионов) от 7,0 до 7,2 Стерильность. Посевы и пересевы на бактериологические питательные среды в течение 35 суточного выдерживания при температуре от плюс 20 до плюс 37 С должны оставаться стерильными. Типичность. В окрашенных, сделанных из вакцины,обнаруживаются грамотрицательные палочки, характерные для возбудителей брадзота,злокачественного отека и эмфизематозного карбункула. Безвредность. Вакцина, введенная подкожно 3 кроликам массой от 2,0 до 2,5 кг в дозе 4 см 3 и 3 морским свинкам массой от 450 до 500 г в дозе 1 см 3,не должна вызывать их гибели в течение 10 суточного наблюдения. Иммуногенная активность. Подкожное двукратное введение вакцины 5 кроликам массой от 2,0 до 2,5 кг в дозе 4 см 3 должно через 20 суток обусловить образование антител в сыворотке их крови в титре не менее 164 в реакции агглютинации. Продолжительность иммунитета. У крупного рогатого скота, привитого двукратно подкожно в дозе 5 см 3, с интервалом 20 суток, длится 12 месяцев. Надежность. Вакцина, введенная подкожно крупному рогатому скоту 5 см 3, должна предохранять от заражения не менее 90 иммунизированных животных. Термостабильность. При температуре от 2 до 8 С- 18 месяцев При температуре от 15 до 25 С - 90 суток при плюс 37 С - 30 суток. Апробация ассоциированной вакцины против брадзота,злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота в неблагополучных по данной инфекции хозяйствах Алматинской области показала, что препарат является безвредным, ареактогенными и высокоиммуногенным препаратом профилактическая эффективность составляет 85 90. Применение ассоциированной вакцины против брадзота,злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота позволит одновременно профилактировать несколько анаэробных инфекций у животных и значительно сократить материальные и трудовые затраты животноводческих хозяйств. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Ассоциированная вакцина против брадзота,злокачественного отека и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота, включающая инактивированный формалином антиген-15 и адъювант, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит инактивированные формалином антигены,34 В-0132,1098 -0133,при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма антиген из штамма 34 В-0132(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 29-31 антиген из штамма 1098 -0133(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида гель гидрата окиси алюминия