Вакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота

(51) 61 39/08 (2010.01) 61 31/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Вакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота,включающая инактивированные формалином антигены 15,В-0130 и адьювант, она дополнительно содержит инактивированный формалином антиген 2/14, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3 ) 24-26 антиген из штамма 2/14(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3 ) 24-26 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4-0,6 гель гидрата окиси алюминия(72) Горелов Юрий Михайлович Сущих Владислава Юрьевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) ВАКЦИНА ПРОТИВ ЭМФИЗЕМАТОЗНОГО КАРБУНКУЛА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой инактивированную вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении,высокоиммуногенной, стабильной, не реактогенной вакцины, создающий напряженный иммунитет Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой инактивированную вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Известна концентрированная гидроокисьалюминиевая формолвакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и овец, содержащая инактивированный антиген из штамма 15,-0290, формалин и гель гидрата окиси алюминия (Инновационный патент 20952 от 14.05.2007 г). Недостатком данной вакцины является то, что она не имеет в своем составе слабовирулентных антигенов, необходимых для высокой иммунологической активности препарата. Задачей изобретения является разработка инактивированной вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота, которая создавала бы напряженный иммунитет при введении ее в организм животного и не обладала бы реактогенными свойствами. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении,высокоиммуногенной, стабильной, не реактогенной вакцины, создающий напряженный иммунитет против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Вакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота,включающая инактивированные формалином антигены 15,-0130 и адъювант,дополнительно содержит инактивированный формалином антиген 2/14, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 24-26 антиген из штаммаВ -0130(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 24-26 антиген из штамма 2/14(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 24-26 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4-0,6 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное Штаммы культур 15,2/14 иВ 0130 депонированы в Лаборатории генофонда по изучению культур микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институте (КазНИВИ). Идентификацию штаммов культур 15,2/14 и В-0130,проводят по основным биологическим свойствам Штаммы характеризуются следующими признаками. Штамм 15 Морфологические свойства. Штамм 15 обладает морфологическими признаками характерными для возбудителя эмфизематозного карбункула крупного рогатого.-15 представляют собой подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами. Культуральные свойства. Штамм 15 растет на жидких питательных средах(МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 37-38 С, с обильным газообразованием, сбраживает галактозу,сахарозу, глюкозу, левулезу, лактозу, разжижает желатину, не образует сероводород и индол. Спорообразование. Штамм 15 образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Капсул штамм 15 не образует. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигена 15 образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Вирулентность. 20-48-часовая культура штамма 15 вызывает гибель морских свинок в дозе 0,4 см 3. Реактогенность. Культура 15, введенная подкожно морским свинкам,кроликам в объеме 0,2 см 3 вызывает воспалительную реакцию на месте введения с повышением местной температуры на 0,5-1,0 С и значительным отеком, а на 2-3 сутки вызывает некроз тканей, гибель животных наступает через 3-4 сутки. Иммуногенность. Морские свинки после введения инактивированного антигена, полученного из разрушенных клеток штамма 15 в дозе 0,5 см 3 в 65-68 случаях приобретают устойчивость к заражению 48-часовой культурой, введенной в дозе 0,2 см 3 в мышцы задней конечности. Инактивированный антиген, полученный из штамма Штаммпри двукратном введении в дозе 3,0 -5,0 см 3 крупному рогатому скоту обуславливает напряженный иммунитет у 75-85, с образованием агглютининов в титрах 116-1128. Реверсабельность. Штамм 15 по основным культуральным, морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма 15 стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штамм 15 отобран нами по интенсивности роста на бактериологических средах и способности накапливать большое количество бактериальной массы. Штамм 2/14 Морфологические свойства. Штамм 2/14 обладает морфологическими признаками характерными для возбудителя эмфизематозного карбункула крупного рогатого.2/14 представляют собой подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами. Культуральные свойства. Штамм 2 /14 растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 3738 С, с обильным газообразованием, сбраживает галактозу, сахарозу, глюкозу, левулезу, лактозу,слабо разжижает желатину, не образует сероводород и индол. Спорообразование. Штамм 2/14 образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Капсул штамм 2/14 не образует. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигена 2/14 образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Вирулентность. Штамм является слабо патогенным для сельскохозяйственных и лабораторных животных. 20-48-часовая культура штамма 2/14 не вызывает гибель морских свинок в дозе 0,5-2,0 см 3. Реактогенность. Культура 2/14, введенная подкожно морским свинкам,кроликам в объеме 3,0 см 3 вызывает воспалительную реакцию на месте введения с повышением местной температуры на 0,5-1,0 С и значительным отеком, гибель животных наступает через 4-5 сутки. Иммуногенность. Морские свинки после введения инактивированного антигена, полученного из разрушенных клеток штамма 2/14 в дозе 2,0 см 3 в 55-60 случаях приобретают устойчивость к заражению 48-часовой культурой, введенной в дозе 2,0 см 3 в мышцы задней конечности. Инактивированный антиген, полученный из штамма Штаммпри двукратном введении в дозе 3,0-5,0 см 3 крупному рогатому скоту обуславливает напряженный иммунитет у 75-85, с образованием агглютининов в титрах 1 32-1128. Реверсабельность. Штамм 2/14 по основным культуральным,морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма 2/14 стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штамм 2/14 отобран нами по интенсивности роста на бактериологических средах и способности накапливать большое количество бактериальной массы. ШтаммВ-0130 Морфологические свойства. ШтаммВ-0130 подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами. Культуральные свойства. ШтаммВ-0130 растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 3738 С, с обильным газообразованием, сбраживает галактозу, сахарозу, глюкозу, левулезу, лактозу,разжижает желатину, не образует сероводород и индол. Спорообразование. ШтаммВ-0130 образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Капсул штаммВ-0290 не образует. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигенаВ 0130 образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Вирулентность. 20-48-часовая культура штаммаВ-0130 вызывает гибель морских свинок в дозе 3,0 см 3. Реактогенность. КультураВ- 0130, введенная подкожно морским свинкам,кроликам в объеме 0,8-1,2 см 3 вызывает воспалительную реакцию на месте введения с повышением местной температуры на 0,5-1,0 С и значительным отеком, а на 3-5 сутки вызывает некроз тканей, гибель животных наступает через 7 сутки. Иммуногенность. Морские свинки после введения инактивированного антигена, полученного из разрушенных клеток штаммаВ- 0130 в дозе 3,0 см 3 в 65-68 случаях приобретают устойчивость к заражению 48-часовой культуройВ-0130, введенной в дозе 0,2 см 3 в мышцы задней конечности. Инактивированный антиген, полученный из штамма Штаммпри двукратном введении в дозе 5,03 см крупному рогатому скоту обуславливает напряженный иммунитет у 75-85, с образованием агглютининов в титрах 116-1128. Реверсабельность. ШтаммВ-0130 по основным культуральным,морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штаммаВ - 0130 стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на 3 питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. ШтаммВ-0130, отобран нами как авирулентный по интенсивности роста на бактериологических средах и способности накапливать значительное количество бактериальной массы. Изобретение иллюстрируется следующими примерами Пример 1. Питательные среды для культивирования клостридий, их инактивации и концентрирования. Для культивирования клостридий используют две среды мясопептонный печеночный бульон(МППБ) под вазелиновым маслом и среду панкреотических гидролизатов казеина,вываренного мясного фарша и дрожжей. Для получения антигенов для вакцины пробирки с МППБ под вазелиновым маслом засеянные культурами 15,2/14 иВ-0130 помещают в термостат с температурой 37 С и выдерживают 24 часа. После проверки чистоты роста путем микроскопии мазков, культуры каждую раздельно, высевают во флаконы объемом 0,4 л со средой ПГКМД. Для засева одного флакона используют весь объем суточной культуры,выращенной в двух пробирках. Посевы выдерживают при 37 С 24 часа и вновь проверяют на чистоту и типичность морфологии. Пример 2. Изготовление вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Полученные культуры используют для засева в бутыли с ПГКМД, в количестве 10-15 от общего объема. Засеянные бутыли помещают на 2-3 суток в термостат при 37 С. Для проверки чистоты и типичности морфологии микробных клеток, выборочно делают мазки и микроскопируют. Чистые культуры с типичной морфологией микроорганизмов в концентрации 2-4 млрд.см 3 с рН 5,5 - 6,5 при температуре 37-39 С обезвреживают формалином, который добавляют в количестве 0,5-0,7 в чистом виде или разведенном до 20 концентрации (пересчет ведут на 40 формальдегид). Формалинизированные культуры выдерживают при температуре 38-42 С в течение 10 суток,периодически перемешивая 2-3 раза в сутки. По истечению указанного срока культуры проверяют на стерильность путем высева на МПБ,МППБ, МПА. Наблюдение за посевами ведут 10 суток, в течение которых они должны оставаться стерильными. В реактор с формалинизированными культурами после установления их стерильности, добавляют стерильный 3 раствор гидрата окиси алюминия(ГОСТ 18287) в количестве 155 к общему объему при рН 4,5-7,0. После добавления гидрата окиси алюминия в реакторы, содержимое хорошо перемешивают и оставляют на 2-5 суток при температуре 12-18 до полного просветления надосадочной жидкости. Отстоявшиеся анакультуры концентрируют путем деконтации над осадочной жидкости в количестве 2/3 объема. Соблюдая правила асептики смешивают оставшиеся части обеих культур в одном реакторе и нагревают до 423 С и при постоянном перемешивании добавляют стерильный горячий (45-60 С) 2-3 раствор агар-агара или желатины из расчета 50 г сухого вещества на 100 дм 3 вакцины. Вакцину вводили двукратно, с интервалом 20 суток, подкожно в область средней трети шеи в дозе 5,0 мл. Наблюдение за опытными животными вели в течение 12 месяцев. Профилактическую эффективность вакцины проверяли в неблагополучном по эмфизематозному карбункулу хозяйстве Алматинской области. В эксперименте используют 4 группы животных по 50 голов (нетели) в каждой, в которых 3 опытные группы и одна контрольная. Пример 3. Вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота вводят подкожно при следующем соотношении компонентов антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 24 антиген из штамма 2/14(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 24 антиген из штаммаВ - 0 1 3 0 (0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 24 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное В опытной группе животных (50 голов) через 10 месяцев заболело 6 голов (12). Таким образом,профилактическая эффективность при таком соотношении компонентов составляет 88, а продолжительность иммунитета 6 месяцев. Пример 4. Вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота вводят также как в примере 3, при следующем соотношении компонентов антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 25 антиген из штамма 2/14(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 25 антиген из штаммаВ - 0 1 3 0(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 25 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,5 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное В иммунизированной группе животных (50 голов) через 12 месяцев заболело 4 головы (8). Таким образом,профилактическая эффективность вакцины против эмфизематозного карбункула составляет 92, а продолжительность иммунитета составляет 12 месяцев. Пример 5. Вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота вводят также как в примере 3, при следующем соотношении компонентов антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 26 антиген из штамма 2/14(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 26 антиген из штаммаВ - 0290(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 26 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,6 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное В опытной группе животных профилактическая эффективность вакцины была такой же, как в примере 5 (92 и продолжительность иммунитета 12 месяцев). В контрольной группе животных (вакцина не применялась) заболело 10 голов (25) животных,причем течение патологического процесса было тяжелее, чем при заболевании в опытных группах. Таким образом,наиболее эффективные результаты иммунизации были достигнуты в примерах 4 и 5, а соотношение компонентов в примере 5 является наиболее оптимальным для серийного выпуска предлагаемой вакцины. Пример 6. Контроль вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Физико-химические и биологические свойства Внешний вид, цвет. Слегка опалесцирующая коричневая жидкость с рыхлым сероватым осадком,легко разбивающимся в гомогенную взвесь. Наличие посторонних примесей. Вакцина не должна содержать посторонних примесей, плесени,не разбивающихся конгломератов. Показатель рН (водородных ионов) от 7,0 до 7,2 Стерильность. Посевы и пересевы на бактериологические питательные среды в течение 35 суточного выдерживания при температуре от плюс 20 до плюс 37 С должны оставаться стерильными. Типичность. В окрашенных, сделанных из вакцины,обнаруживаются грамотрицательные палочки,характерные для возбудителя эмфизематозного карбункула. Безвредность. Вакцина, введенная подкожно 3 кроликам массой от 2,0 до 2,5 кг в дозе 4 см 3 и 3 морским свинкам массой от 450 до 500 г в дозе 1 см 3,не должна вызывать их гибели в течение 10 суточного наблюдения. Иммуногенная активность. Подкожное двукратное введение вакцины 5 кроликам массой от 2,0 до 2,5 кг в дозе 4 см 3 должно через 20 суток обусловить образование антител в сыворотке их крови в титре не менее 164 в реакции агглютинации. Продолжительность иммунитета. У крупного рогатого скота, привитого двукратно подкожно в дозе 5 см 3, с интервалом 20 суток, длится 12 месяцев. Надежность. Вакцина, введенная подкожно крупному рогатому скоту 5 см 3, должна предохранять от заражения не менее 90 иммунизированных животных. Термостабильность. При температуре от 2 до 8 С- 18 месяцев при температуре от 15 до 25 С - 90 суток при плюс 37 С - 30 суток. Апробация вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота в неблагополучных по данной инфекции хозяйствах Алматинской области показала, что препарат является безвредным,ареактогенными и высокоиммуногенным препаратом профилактическая эффективность составляет 88 92. Использование вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота в ветеринарной практике позволит значительно снизить ежегодную заболеваемость животных эмфизематозным карбункулом, а также сократить материальные и трудовые затраты животноводческих хозяйств на ликвидационные мероприятия. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Вакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота,включающая инактивированные формалином антигены 15,-0130 и адъювант, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит инактивированный формалином антиген 2/14, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма-15(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 24-26 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4-0,6 гель гидрата окиси алюминия