Вакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота

(51) 61 39/08 (2006.01) 61 31/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении,высокоиммуногенной, стабильной, не реактогенной вакцины, создающий напряженный иммунитет против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Вакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота,включающая инактивированный формалином антиген 15 и адьювант, она дополнительно содержит инактивированный формалином антигенВ - 0290, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 39-41 антиген из штаммаВ - 0290(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 39-41 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4-0,6 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное.(72) Горелов Юрий Михайлович Сущих Владислава Юрьевна Каримов Абдилкарим Абдрахманович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский ветеринарный институт Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Научнопроизводственный центр животноводства и ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(54) ВАКЦИНА ПРОТИВ ЭМФИЗЕМАТОЗНОГО КАРБУНКУЛА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой инактивированную вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. 20952 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой инактивированную вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Известна концентрированная гидроокисьалюминиевая формолвакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и овец, содержащая инактивированный антиген из штамма 15,формалин и гель гидрата окиси алюминия (ТУ 640 РК 00482536-РГП-07-99). Недостатком данной вакцины является то, что она не имеет в своем составе авирулентных антигенов, необходимых для высокой иммунологической активности препарата. Задачей изобретения является разработка инактивированной вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота, которая создавала бы напряженный иммунитет при введении ее в организм животного и не обладала бы реактогенными свойствами. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении,высокоиммуногенной, стабильной, не реактогенной вакцины, создающий напряженный иммунитет против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Вакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота,включающая инактивированный формалином антиген 15 и адьювант, дополнительно содержит инактивированный формалином антигенВ - 0290, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 39-41 антиген из штаммаВ - 0290(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 39-41 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4-0,6 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное Штаммы, используемые для изготовления вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота 5 депонированы в ВГНКИ ветпрепаратов. ШтаммВ - 0290 - эпизоотический,полученный от крупного рогатого скота. Указанные штаммы культур депонированы в лаборатории Музей культур микроорганизмов ДГП Научно-исследовательском ветеринарном институте (КазНИВИ). Идентификацию штаммов культур 15 иВ - 0290 входящих в консорциум, проводят по основным биологическим свойствам(морфологическим,культуральным,биохимическим),согласно определителю бактерий Берджи, Москва (1997 г.). Штаммы характеризуются следующими признаками. Штамм 15. 2 15 обладает морфологическими признаками характерными для возбудителя эмфизематозного карбункула крупного рогатого.-15 представляют собой подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами. Культуральные свойства. Штамм 15 растет на жидких питательных средах(МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 37-38 С, с обильным газообразованием, сбраживает галактозу,сахарозу, глюкозу, левулезу, лактозу, разжижает желатину, не образует сероводород и индол. Спорообразование. Штамм 15 образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Капсул штамм 15 не образует. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигена 15 образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Вирулентность. 20-48-часовая культура штамма 15 вызывает гибель морских свинок в дозе 0,4 см 3. Реактогенность. Культура 15, введенная подкожно морским свинкам,кроликам в объеме 0,2 см 3 вызывает воспалительную реакцию на месте введения с повышением местной температуры на 0,5-1,0 С и значительным отеком, а на 2-3 сутки вызывает некроз тканей, гибель животных наступает через 3-4 сутки. Иммуногенность. Морские свинки после введения инактивированного антигена, полученного из разрушенных клеток штамма 15 в дозе 0,5 см 3 в 65-68 случаях приобретают устойчивость к заражению 48-часовой культурой, введенной в дозе 0,2 см 3 в мышцы задней конечности. Инактивированный антиген, полученный из штамма Штаммпри двукратном введении в дозе 3,0-5,0 см 3 крупному рогатому скоту обуславливает напряженный иммунитет у 75-85, с образованием агглютининов в титрах 116-1128. Реверсабельность. Штамм 15 по основным культуральным, морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма 15 стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штамм 15 отобран нами по интенсивности роста на бактериологических средах и способности накапливать большое количество бактериальной массы. 20952 Штамм-0290. Морфологические свойства. Штамм-0290 подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами. Культуральные свойства. Штамм-0290 растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 3738 С, с обильным газообразованием, сбраживает галактозу, сахарозу, глюкозу, левулезу, лактозу,разжижает желатину, не образует сероводород и индол. Спорообразование. ШтаммВ - 0290 образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Капсул штамм-0290 не образует. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигенаВ 0290 образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Вирулентность. 20-48-часовая культура штаммаВ 0290 вызывает гибель морских свинок в дозе 3,0 см 3. Реактогенность. КультураВ- 0290, введенная подкожно морским свинкам,кроликам в объеме 0,8-1,2 см 3 вызывает воспалительную реакцию на месте введения с повышением местной температуры на 0,5-1,0 С и значительным отеком, а на 3-5 сутки вызывает некроз тканей, гибель животных наступает через 7 сутки. Иммуногенность. Морские свинки после введения инактивированного антигена, полученного из разрушенных клеток штаммаВ - 0290 в дозе 3,0 см 3 в 65-68 случаях приобретают устойчивость к заражению 48-часовой культуройВ - 0290, введенной в дозе 0,2 см 3 в мышцы задней конечности. Инактивированный антиген, полученный из штамма Штаммпри двукратном введении в дозе 5,0 см 3 крупному рогатому скоту обуславливает напряженный иммунитет у 75-85, с образованием агглютининов в титрах 116-1128. Реверсабельность. ШтаммВ 0290 по основным культуральным,морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штаммаВ - 0290 стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. ШтаммВ - 0290, отобран нами как авирулентный по интенсивности роста на бактериологических средах и способности накапливать значительное количество бактериальной массы. Изобретение иллюстрируется следующими примерами Пример 1 Питательные среды для культивирования клостридий, их инактивация и концентрирование Для культивирования клостридий используют две среды мясопептонный печеночный бульон(МППБ) под вазелиновым маслом и среду панкреотических гидролизатов казеина,вываренного мясного фарша и дрожжей (ПГКМД)(а.с.652216). Культивирование штаммов 15 иВ - 0290. Для получения антигенов для вакцины пробирки с МППБ под вазелиновым маслом засеянные культурами 15 иВ - 0290 помещают в термостат с температурой 37 С и выдерживают 24 часа. После проверки чистоты роста путем микроскопии мазков,культуры - каждую раздельно, высевают во флаконы объемом 0,4 л со средой ПГКМД. Для засева одного флакона используют весь объем суточной культуры, выращенной в двух пробирках. Посевы выдерживают при 37 С 24 часа и вновь проверяют на чистоту и типичность морфологии. Пример 2. Изготовление вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота Полученные культуры используют для засева в бутыли с ПГКМД, в количестве 10-15 от общего объема. Засеянные бутыли помещают на 2-3 суток в термостат при 37 С. Для проверки чистоты и типичности морфологии микробных клеток, выборочно делают мазки и микроскопируют. Чистые культуры с типичной морфологией микроорганизмов в концентрации 2-4 млрд.см 3 с рН 5,5-6,5 при температуре 37-39 С обезвреживают формалином, который добавляют в количестве 0,5-0,7 в чистом виде или разведенном до 20 концентрации (пересчет ведут на 40 формальдегид). Формалинизированные культуры выдерживают при температуре 38-42 С в течение 10 суток,периодически перемешивая 2-3 раза в сутки. По истечению указанного срока культуры проверяют на стерильность путем высева на МПБ, МППБ, МПА. Наблюдение за посевами ведут 10 суток, в течение которых они должны оставаться стерильными. В реактор с формалинизированными культурами после установления их стерильности, добавляют стерильный 3 раствор гидрата окиси алюминия(ГОСТ 18287) в количестве 155 к общему объему при рН 4,5-7,0. После добавления гидрата окиси алюминия в реакторы, содержимое хорошо перемешивают и оставляют на 2-5 суток при температуре 12-18 до полного просветления надосадочной жидкости. Отстоявшиеся анакультуры концентрируют путем деконтации над осадочной жидкости в количестве 2/3 объема. Соблюдая правила асептики смешивают оставшиеся части обеих культур в одном реакторе и нагревают до 423 С и при постоянном перемешивании добавляют стерильный 3 20952 горячий (45-60 С) 2-3 раствор агар-агара или желатины из расчета 50 г сухого вещества на 100 дм 3 вакцины. Вакцину вводили двукратно, с интервалом 20 суток, подкожно в область средней трети шеи в дозе 5,0 мл. Наблюдение за опытными животными вели в течение 12 месяцев. Профилактическую эффективность вакцины проверяли в неблагополучном по эмфизематозному карбункулу хозяйстве Алматинской области. В эксперименте используют 4 группы животных по 50 голов (нетели) в каждой, в которых 3 опытные группы и одна контрольная. Пример 3. Вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота вводили подкожно при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 39 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное В опытной группе животных (50 голов) через 10 месяцев заболело 6 голов (12). Таким образом,профилактическая эффективность при таком соотношении компонентов составляет 88, а продолжительность иммунитета 6 месяцев. Пример 4. Вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота вводят также как в примере 3, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 40 антиген из штаммаВ - 0290(0,8-1,5 млрд. м. т. в см 3) 40 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,5 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное В иммунизированной группе животных (50 голов) через 12 месяцев заболело 4 головы (8). Таким образом,профилактическая эффективность вакцины против эмфизематозного карбункула составляет 92, а продолжительность иммунитета составляет 12 месяцев. Пример 5. Вакцину против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота вводят также как в примере 3, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма 15(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 41 антиген из штаммаВ - 0290(0,8-1,5 млрд. м.т. в см 3) 41 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,6 гель гидрата окиси алюминия(6 раствор) остальное 4 В опытной группе животных профилактическая эффективность вакцины была такой же, как в примере 5 (92 и продолжительность иммунитета 12 месяцев). В контрольной группе животных (вакцина не применялась) заболело 10 голов (25) животных,причем течение патологического процесса было тяжелее, чем при заболевании в опытных группах. Таким образом,наиболее эффективные результаты иммунизации были достигнуты в примерах 4 и 5, а соотношение компонентов в примере 5 является наиболее оптимальным для серийного выпуска предлагаемой вакцины. Пример 6. Контроль вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Физико-химические и биологические свойства. Вакцина должна соответствовать следующим требованиям и нормам. Внешний вид, цвет. Слегка опалесцирующая коричневая жидкость с рыхлым сероватым осадком,легко разбивающимся в гомогенную взвесь. Наличие посторонних примесей. Вакцина не должна содержать посторонних примесей, плесени,не разбивающихся конгломератов. Показатель рН (водородных ионов). От 7,0 до 7,2 Стерильность. Посевы и пересевы на бактериологические питательные среды в течение 35 суточного выдерживания при температуре от плюс 20 до плюс 37 С должны оставаться стерильными. Типичность. В окрашенных, сделанных из вакцины,обнаруживаются грамотрицательные палочки,характерные для возбудителя эмфизематозного карбункула. Безвредность. Вакцина, введенная подкожно 3 кроликам массой от 2,0 до 2,5 кг в дозе 4 см 3 и 3 морским свинкам массой от 450 до 500 г в дозе 1 см 3, не должна вызывать их гибели в течение 10 суточного наблюдения. Иммуногенная активность. Подкожное двукратное введение вакцины 5 кроликам массой от 2,0 до 2,5 кг в дозе 4 см 3 должно через 20 суток обусловить образование антител в сыворотке их крови в титре не менее 164 в реакции агглютинации. Продолжительность иммунитета. У крупного рогатого скота, привитого двукратно подкожно в дозе 5 см 3, с интервалом 20 суток, длится 12 месяцев. Надежность. Вакцина, введенная подкожно крупному рогатому скоту 5 см 3,должна предохранять от заражения не менее 90 иммунизированных животных. Термостабильность. При температуре от 2 до 8 С - 18 месяцев При температуре от 15 до 25 С 90 суток при плюс 37 С - 30 суток. Апробация вакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота в неблагополучных по данной инфекции хозяйствах Алматинской области показала, что препарат является безвредным,ареактогенными и высокоиммуногенным препаратом 20952 профилактическая эффективность составляет 88 92. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Вакцина против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота,содержащая инактивированный формальном антиген 15, формалин и гель гидрата окиси алюминия, отличающаяся тем, что дополнительно содержит инактивированный формалином антиген-0290, при следующем соотношении компонентов, мас. антиген из штамма 15 39-41 антиген из штамма-0290 39-41 формалин, содержащий не менее 36,5 формальдегида 0,4-0,6 гель гидрата окиси алюминия