Способ получения туберкулина

(51) А 61 К 39/04 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения туберкулина включает в себя выращивание в термальной комнате на среде Сотона микобактерий бычьего вида шт.8 ВИ-ЭВ при температуре 38 С в течение 8 недель, стерилизацию автоклавированием при температуре 120 С в течение 1,5-2 ч, отделение бактериальной массы от культуральной жидкости,целевой продукт получают путем дальнейшего ее концентрирования на ультрафильтрационном разделительном аппарате на полых волокнах АР-2,0 под давлением до 0,2 мПа с задержанием белков с молекулярной массой от 15 кДа до 300 кДа. После концентрации полученный раствор разводят в 10 глицеринофизиологическом растворе до концентрации белка 1 мг/см 3. В качестве консерванта используют фенол с содержанием в препарате до 0,25. Проведенные испытания приготовленного по предлагаемому способу целевого продукта в сравнении с коммерческим ППД-туберкулином подтвердили высокую активность опытной серии туберкулина с преимуществом его по специфичности, экологической безвредности и экономической эффективности.(72) Тургенбаев Кайрат Алтынбекович Плазун Александр Анатольевич(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Научно производственный центр БиоВет(56) Инструкция по изготовлению и контролю ППД-туберкулина для млекопитающих,стандартный раствор, Алматы, 2001(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано для диагностики туберкулеза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке способа изготовления туберкулина обладающего большей специфичностью в отношении микобактерий бычьего вида, а также минимальными потерями продукта в процессе производства и своей экологической чистотой. 20951 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано для диагностики туберкулеза животных. Известен способ получения туберкулина для млекопитающих включающий культивирование микобактерий бычьего вида в течение 8 недель на среде Сотона, автокловирования при температуре 120 С в течение 1,5-2 ч и использование культуральной жидкости, которую подвергают ультрафильтрации, бактериальной массы, после дезинтеграции в присутствии ПАВ с отделением туберкулопротеидов, смешивания культуральной жидкости и туберкулопротеидов с последующим осаждением целевого продукта в присутствии сернокислого аммония центрифугированием,удалением остатка сернокислого аммония из целевого продукта путем осмоса и разбавлением последнего до нужной концентрации глицеринофизиологическом раствором. В качестве консерванта используют фенол с содержанием в препарате до 0,25. (Инструкция по изготовлению и контролю ППД-туберкулина для млекопитающих,стандартный раствор, Алматы, 2001). Недостатком известного способа является многоступенчатая технология изготовления,загрязнение окружающей среды сернокислым аммонием, потерей до 30 действующего начала целевого продукта в процессе осаждения сернокислым аммонием. Задачей изобретения является разработка способа оптимизации технологии получения туберкулина для млекопитающих. Технический результат - упрощение технологии изготовления целевого продукта, повышение специфичности, минимальная потеря продукта в процессе производства, снижение загрязнения окружающей среды, повышение рентабельности до 50. Технический результат достигается тем, что,целевой продукт получают только из культуральной жидкости, разделяют в ультрафильтрационном аппарате на полых волокнах АР-2,0 под давлением до 0,2 мПа с выделением основы целевого продукта в виде раствора туберкулопротеида с молекулярной массой от 15 кДа до 300 кДа, культуральную жидкость концентрируют в 3-5 раз от первоначального объема и минуя стадию осаждения сернокислым аммонием концентрат разводят в 10 глицеринофизиологическом растворе с содержанием белка до 1 мг/см 3. Способ осуществляется следующим образом. Культуральную жидкость, собранную после культивирования микобактерий бычьего вида в течение 8 недель на среде Сотона, стерилизуют автоклавированием и, пропуская под давлением до 0,2 мПа через ультрафильтрационную колонку с полыми волокнами -2-300 П, удаляют белки с молекулярной массой свыше 300 кДа. После чего жидкость пропускают через ультрафильтрационную колонку АР-2-15 ПС под давлением до 0,2 мПа для удаления из нее белков с молекулярной массой ниже 15 кДа. В процессе ультрафильтрации концентрация раствора в целом повышается в 3-5 раз за счет 2 удаление воды. Полученный концентрат разводят в 10 глицерино-физиологическом растворе с содержанием белка до 1 мг/см 3. В качестве консерванта используют фенол с содержанием в препарате до 0,25. Стерильность раствора проверяют путем посева на МП, МПБ и среду Сабуро. Безвредность препарата проверяют на белых мышах по существующей методике,отсутствие сенсибилизирующих свойств и биологическую активность проверяют па морских свинках по ГОСТу 16739-М., 1988 г. путем внутрикожного введения. Готовый препарат используют в качестве аллергена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Пример осуществления способа. Микобактерии бычьего вида шт.8 ВИЭВ выращивали в термальной комнате при 38 С в течение 8 недель на среде Сотона в биобутылях, стерилизовали автоклавированием при температуре 120 С в течение 1,5-2 ч, отделяли бактериальную массу от культуральной жидкости фильтрованием. Культуральную жидкость концентрировали на ультрафильтрационном мембранно-разделительном аппарате на полых волокнах АР-2,0 под давлением до 0,2 мПа задерживающих белки с молекулярной массой от 15 кДа до 300 кДа, Культуральную жидкость концентрировали в 3-5 раз от первоначального объема. После концентрации полученный раствор разводили в 10 глицеринофизиологическом растворе до концентрации белка 1 мг/см 3. В качестве консерванта использовали фенол с содержанием в препарате до 0,25. Стерильность аллергена проверяли путем посева его на питательные среды МПА, МПБ и среду Сабуро. Па каждую среду (по пять пробирок) высевали по 0,25 см 3 препарата. Посевы выдерживали в термостате при 37 С для МПА, МПБ и при 20-22 С для среды Сабуро. Через 10 дней в пробирках роста не обнаружено,что свидетельствовало о стерильности препарата. Безвредность аллергена проверяли на здоровых белых мышах (10 особей). Пяти мышам подкожно вводили по 0,25 см 3 аллергена, растворенного в стерильном физиологическом растворе из расчета 1 мг в 1 см 3 пять белых мышей - контрольные(препарат не вводили). В течение 10 дней все мыши,которым вводили аллерген, остались здоровыми. На месте введения туберкулина у этих животных изменений не обнаружено, что свидетельствовало о безвредности препарата. Отсутствие сенсибилизирующих свойств аллергена проверяли на здоровых морских свинках(по шесть голов) для каждой серии. Трем морским свинкам вводили трехкратно по 500 туберкулиновых единиц (ТЕ) препарата в объеме 0,1 см 3 растворителя с интервалом 5 сут, три свинки контрольные. Через 15 сут всем морским свинкам вводили внутрикожно по 5000 ТЕ туберкулина в 0,1 см 3 растворителя. Через 24 ч проводили учет реакции. У всех животных на месте введения наблюдали покраснение размером не более 5 мм. Эти данные указывали на отсутствие 20951 сенсибилизирующих свойств у предлагаемого препарата. Биологическую активность аллергена определяли методом серийных разведений на морских свинках, предварительно зараженных культурой микобактерий туберкулеза бычьего вида(М.8). Препарат вводили внутрикожно в количестве 0,00002 мг, 0,0001 мг, 0,0005 мг в 0,1 см 3 физиологического раствора , сравнивая их с ППД-туберкулином для млекопитающих приготовленным в ТОО НПЦ БиоВет по утвержденной 05.07.2001 г. инструкции в разведении 1,5 и 25 ТЕ. Реакцию учитывали через 24 и 48 ч путем измерения образовавшихся папул. Результаты представлены в табл. 1, 2. Таблица 1 Интенсивность реакций у морских свинок на введение аллергенов, в мм через 24 ч ППД-туберкулин, в ТЕ Испытуемая серия туберкулина, в мг свинок 1 5 25 125 0,00002 0,0001 0,0005 0,0025 1 6,5 8,5 11 13,5 7,5 10 12 13,5 2 10,5 9 11,5 14 10 9 12,5 14,5 3 8 8,5 10 13,5 7 9,5 11 12 4 9 8,5 9 13,5 9,5 10 11,5 13,5 5 9 10 11,5 12,5 7,5 9,5 11 11 Сумма 43 44,5 53 67 41,5 48 58 64,5 Итого Б 207,5 Итого А 212 Количество ТЕ в 1 см 3 испытуемого аллергена определяли по формуле А Кх 50000 где,Б Б - сумма интенсивности реакций у морских свинок на ППД-туберкулин А - сумма интенсивности реакций у морских свинок на испытуемый аллерген. Таким образом,активность аллергена испытуемой серии в 1 см 3 через 24 ч составила 212 Кх 5000051084 ТЕ 207 ,5 Таблица 2 Интенсивность реакций у морских свинок на введение аллергенов, в мм через 48 ч ППД-туберкулин, в ТЕ Испытуемой серии туберкулина, в мг свинок 1 5 25 125 0,00002 0,0001 0,0005 0,0025 1 4,5 7 9 11 6 9 11,5 11 2 8 8 9 12,5 8,5 7,5 13,5 12 3 6,5 7 9 12 6 8 9,5 8,5 4 7 7 7 11,5 8,5 9,5 10,5 12 5 7 8 10 10,5 6 8 9 10,5 Сумма 33 39 44 57,5 35 42 54 54 Итого Б 173,5 Итого А 185 Активность аллергена испытуемой серии в 1 мг через 48 ч составила 185 К х 5000053314 ТЕ 173,5 В результате проведенных испытаний установлено, что приготовленный по предлагаемому способу туберкулин проявляет активность наряду с коммерческим ППД-туберкулином для млекопитающих на морских свинках,сенсибилизированных М.8. Специфичность препарата была проверена на 20 морских свинках средней живой массой 300 г. За 30 дней до испытания специфичности туберкулина животные были разделены на группы по 5 животных в каждой и сенсибилизированы подкожным введением суспензии различных штаммов микобактерий в дозе 0,001 мг на голову. Так, животным первой группы вводили суспензию М. , животным второй группы вводили суспензию М. ,животным третей группы вводили суспензию М., животным четвертой группы вводили суспензию М.. Каждой из 20 сенсибилизированной свинок внутрикожно в правый бок был введен стандартный раствор ППДтуберкулина в дозе 0,1 см 3 с содержанием 20 ТЕ, а в левый бок - испытуемая серия туберкулина в такой же дозе и концентрации. Учет реакции проводили через 24 часа путем визуального наблюдения наличия папулы, зарисовки ее контуров и последующего определения ее размеров. Результаты исследований представлены в таблице 3. Таблица 3 Интенсивность реакций у морских свинок на введение аллергенов в мм, через 24 и 48 часов. Размеры папул, в мм на введениегруппживотных ППД-туберкулина испытуемой серии туберкулина 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 1 2 3 4 5 6 1 8 8 2 6 7 3 В результате проведенных исследований установлено, что приготовленный по предлагаемому способу туберкулин, проявляет специфичность наряду с коммерческим ППД-туберкулином для млекопитающих на морских свинках,сенсибилизированных М.8 и М. . В то же время испытуемый препарат инертен по отношению к морским свинкам,сенсибилизированным М.и М. , тогда как ППД-туберкулин проявляет активность еще и на морских свинках, сенсибилизированных М. . Полученные данные свидетельствуют, что туберкулин, изготовленный по предлагаемому способу соответствует требованиям ТУ 19 РК 38951407-РГП -05-2001 ППД-туберкулин для млекопитающих, стандартный раствор. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения туберкулина, включающий культивирование микобактерии бычьего вида штамм 8 в термальной комнате при 38 С в течение 8 недель на среде Сотона в биобутылях,стерилизацию автоклавированием при температуре 120 С в течение 1,5 2 ч. отделение бактериальной массы от культуральной жидкости концентрацией ее ультрафильтрацией, отличающийся тем, что,целевой продукт получают только из культуральной жидкости,которую разделяют в ультрафильтрационном аппарате на полых волокнах АР-2,0 под давлением до 0,2 мПа с выделением основы целевого продукта в виде раствора туберкулопротеида с молекулярной массой от 15 кДа до 300 кДа, культуральную жидкость концентрируют в 3-5 раз от первоначального объема и концентрат разводят в 10 глицеринофизиологическом растворе с содержанием белка до 1 мг/см 3.