Способ промышленного получения туберкулина очищенного (ППД) для птиц

(51)7 61 39/04, 61 39/35 КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(56) Способ получения безальбумозного туберкулина, а. с.960215.1, 1996(54) СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛИНА ОЧИЩЕННОГО(57) Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии, в частности к способу получения биологических препаратов и может быть использован при изготовлении аллергенов для диагностики туберкулеза животных и птиц. Способ промышленного получения туберкулина очищенного (ПДД) для птиц заключается в том, что микобактерии туберкулеза птичьего вида культивируют на питательной среде, получают бактериаль ную массу и инактивируют е автоклавированием при 1 ати в течение 90 мин, отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости центрифугированием, освобождают культуральную жидкость от крупномолекулярных белков и полисахаридов фильтрованием через однослойный асбестовый фильтр Ф, затем культуральную жидкость центрифугируют на ОТР-1 при 8000 об/мин в течение 30-40 мин, осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют деминерализованную воду до содержания туберкулопротеина 0,68-0,74 мг/мл и доведения аллергенной активности целевого продукта до 50-56 тыс ТЕ в 1 мл. Предложенный способ позволяет получить высокоактивный туберкулин на основе микобактерии туберкулеза птичьего вида, а технология его осуществления приемлема для промышленного производства. 13391 Способ относится к области ветеринарной иммунологии, в частности к способу получения биологических препаратов и может быть использован при изготовлении аллергенов для диагностики туберкулеза животных и птиц. Известен способ получения туберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза на синтетической среде, термоинактивацию микобактерий туберкулеза, освобождение культуральной жидкости от бакмассы путем фильтрации, выделение белков из культуральной жидкости последовательным многократным осаждением трихлоруксусной кислотой и сульфатом аммония, стерильную фильтрацию через асбестосодержащие фильтры(Инструкция по получению и контролю туберкулина очищенного ППД для млекопитающих. Утверждена ГУ ветеринарии МСХ СССР, 1985). Недостатком известного способа является то, что применяемые при получении туберкулина трихлоруксусная кислота, сернокислый аммоний, а также проведение диализа и многократная фильтрация приводят к резкому уменьшению содержания протеина и полисахаридов, в результате чего снижается специфичность и активность целевого продукта. Известен способ получения аллергена для диагностики туберкулеза, в котором вместо осаждения белков из культуральной жидкости, последнюю подвергают ультрафильтрации на мембранах с номинальной отсекаемой молекулярной массой(НОММ) 100 кДа и концентрированию на мембранах с НОММ 15 кДа. Недостатком известного способа является то, что ультрафильтрационное фракционирование и концентрирование больших объемов культуральной жидкости технологически трудно осуществимо изза длительности процессов и значительных потерь выделяемого белка. Наиболее близким к изобретению является способ получения безальбумозного туберкулина, включающий культивирование микобактерий туберкулеза бычьего вида на питательной среде в течение 5560 дней, инактивирование путем автоклавирования в течение 2-3 часов и отделение бактериальной массы от культуральной жидкости, добавление к последней дистиллированной воды (Способ получения безальбумозного туберкулина, а. с.960215.1,1996). Недостаток известного способа в том, что используется вирулентный штамм микобактерий туберкулеза бычьего вида и данный способ предназначен для получения туберкулина млекопитающих,отсюда сроки и режим культивирования и экспозиция автоклавирования культуральной жидкости с бактериальной массой отличаются. Предложенный способ промышленного получения туберкулина очищенного (ПДД) для птиц, заключается в том, что микобактерий туберкулеза птичьего вида культивируют на питательной среде,получают бактериальную массу и инактивируют е автоклавированием при 1 ати в течение 90 мин, отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости центрифугированием, освобождают куль 2 туральную жидкость от крупномолекулярных белков и полисахаридов фильтрованием через однослойный асбестовый фильтр Ф, затем культуральную жидкость центрифугируют на ОТР-1 при 8000 об/мин в течение 30-40 мин, осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют деминерализованную воду до содержания туберкулопротеина 0,68-0,74 мг/мл и доведения аллергенной активности целевого продукта до 50-56 тыс ТЕ в 1 мл. Способ позволяет получить высокоактивный туберкулин на основе микобактерий туберкулеза птичьего вида, а технология его осуществления приемлема для промышленного производства. Способ осуществляется следующим образом. Готовят синтетическую среду,содержащую следующие ингредиенты в граммах на 1 литр диминерализованной воды лимонной кислоты - 10,0 фосфорнокислого калия 2 зам. - 5,0 сернокислого магния - 0,5 сернокислого железа - 0,05 сернокислого цинка - 0,1 углекислого натрия - 0,5 хлористого кобальта - 0,002 глицерина - 50,0. Полученную смесь фильтруют через ватно-марлевый фильтр,разливают по 1,5-1,7 л в 3-литровые биобутыли и стерилизуют при 0,5 ати 10 минут. Пример 1. На приготовленную питательную среду проводят посев культур микобактерий туберкулеза птичьего вида и выращивают микроорганизмы при температуре 40-42 С в течение 40-45 суток. Выращенную культуру микобактерий вместе со средой автоклавируют при 1 ати в течение 90 минут. Затем освобождают культуральную жидкость от бактериальной массы, проводят фильтрацию через асбестовый фильтр Ф и центрифугируют на ОТР-1 в течение 30-40 минут. Определяют предварительно содержание белка. Биохимические исследования культуральной жидкости после автоклавирования в режиме 1 ати 90 минут показали, что количество белка при культивировании в течение 35 суток составляет 2,80,03 при культивировании 40 суток - 3,1-0,01 при культивировании 45 суток - 3,2-0,05 мг. Дальнейшее увеличение срока культивирования не приводило к повышению содержания белка в культуральной жидкости. Полученный целевой препарат стандартизируют по содержанию белка в соответствии с ГОСТом 16739 (добавляют диминерализованной воды до содержания туберкулопротеина 0,68-0,74 мг в 1 мл),стерилизуют при 0,5 ати в течение 20 минут, определяют биологическую активность (ГОСТ 16739). В силу того, что укорачиваются сроки культивирования до 40-45 сут. и автоклавирования до 90 минут, уменьшается износ дорогостоящего оборудования, расход энергоемкости в производстве, себестоимость препарата. А применение фильтрации культуральной жидкости через асбестовые фильтры и центрифугирование на ОТР-1 позволяют повысить аллергенную активность и выход доз туберкулина. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоактивный туберкулин для птиц с приемлемой технологией для промышленного производства. 13391 Аллергенную активность туберкулина проверяли в лабораторных условиях на морских свинках. В качестве контроля использовали коммерческий Активность промышленного очищенного туберкулина для птиц в опыте на морских свинках в сравнении с коммерческим препаратомживотных 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Итого Вычисляем сумму средних диаметров папул на испытуемую серию туберкулина и сумму средних диаметров папул на контрольную серию туберкулина 185,092,0277,0 181,595,0276,5 Активность испытуемой серии туберкулина равна (277,0276,5)х 5000050,0904 ТЕ, т. е. 50 тыс. ТЕ содержится в 1 мл основного раствора контрольной серии туберкулина. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ промышленного получения туберкулина очищенного для птиц, включающий культивирование микобактерий туберкулеза на питательной среде, получение бактериальной массы и ее инактива Известный туберкулин 20,0 10,5 22,5 11,5 16,0 7,5 21,5 13,0 18,0 16,0 22,5 8,5 27,5 10,0 27,5 11,0 19,5 13,0 181,5 95,0 цию автоклавированием, отделение бактериальной массы от культуральной жидкости, отличающийся тем, что культивируют микобактерии туберкулеза птичьего вида, бактериальную массу инактивируют автоклавированием при 1 ати в течение 90 мин, отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости центрифугированием, освобождают культуральную жидкость от крупномолекулярных белков и полисахаридов фильтрованием через однослойный асбестовый фильтр Ф, затем ее центрифугируют на ОТР-1 при 8000 об/мин в течение 3040 мин, осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют деминерализованную воду до содержания туберкулопротеина 0,68-0,74 мг/мл и доведения аллергенной активности целевого продукта до 50-56 тыс. ТЕ в 1 мл.