Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки

(51) 61 39/10 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в повышении специфичности,чувствительности,иммуногенности и стандартизуемости получаемого антигена без значительных изменений его антигенной структуры. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки,включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта достигается тем, что в качестве посевного материала используют производственный штамм 10/2,который смывают физиологическим раствором,фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 100 млрд. м.к./см 3 взвесь бруцелл, которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30 мин, после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт. 2 табл.(72) Абулхаиров Габид Шамутович Мустафин Батыржан Муафикович Михалев Александр Николаевич Дюсенов Сайран Мырзаханович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский ветеринарный институт Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Научнопроизводственный центр животноводства и ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под ред. М.О. Биргера. -М. Медицина, 1982, - с.52(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при производстве биопрепаратов для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. 20953 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при производстве биопрепаратов для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Известен способ изготовления бруцеллезного антигена для получения диагностической сыворотки, включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование,отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под ред. М.О. Биргера. М. Медицина, 1982. -с.52. Недостатком данного способа является то, что изготовленный антиген не имеет высоких качественных показателей. Задачей изобретения является разработка бруцеллезного антигена с более высокими качественными характеристиками. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в повышении специфичности, чувствительности, иммуногенности и стандартизуемости получаемого антигена без значительных изменений его антигенной структуры. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки,включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта, достигается тем, что в качестве посевного материала используют производственный штамм 10/2,который смывают физиологическим раствором,фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 100 млрд. м.к./см 3 взвесь бруцелл, которую инактивируют выдерживанием на водяной бане при температуре 80 С в течение 30 мин, после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт. Производственный штамм 10/2 используют для изготовления диагностических препаратов. Указанный штамм бактерий депонирован в лаборатории Музей культур микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Идентификацию штамма бактерий вида контурированные, -форма, в проходящем свете янтарные, прозрачные. Накопление бакмассы наблюдают через 48 час выращивания. В питательном бульоне бруцеллы образуют хлопчатый осадок с зоной просветления над осадком. Аэробы. Оптимальная температура выращивания 37 С, рН 6,8-7,0. Биохимические свойства. Обладают каталазной активностью. Проба на диссоциацию. По Уайт-Вилсону колонии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет с синеватым оттенком. Проба с трипафлавином(1500) и реакция термоагглютинации положительные. Антигенная структура. Содержат типичный набор антигенных детерминант, характерных для форм бруцелл,т.е. агглютинируются антибруцеллезной сывороткой и не вступают в реакцию с -антибруцеллезной сывороткой. Патогенные свойства. При определении вирулентности по методу Коротича-Голота установлено, что штамм 10/2 имеет низкую вирулентность. Серологические свойства. Антиген из бруцелл данного штамма обладает высокой диагностической эффективностью при исследовании сывороток крови животных на инфекциооные заболевания,вызываемые возбудителями вида В Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотроф. Тип катаболизма - аэроб. Оптимальый рН 6,8-7,0. Источники углерода глюкоза, глицерин. Источники азота -аланин, -аланин, аспарагин, - аспарагин, -глутаминовую кислоту,-серин и адонитол. Источники серы цистин. Биохимические маркерные признаки обладает положительной каталазной и отрицательной оксидазной активностью. Физиологические маркерные признаки хемоорганотроф, не растет без органических источников азота, требуется наличие СО 2 для роста. Хранение на питательной среде. Предварительно культивируют на эритрит-агаре при оптимальной температуре в аэробных условиях,хранят при температуре 4-6 С в течение 3-4 недель,максимальная продолжительность сохранения жизнеспособности хорошая,при хранении происходит остановка роста,свойства не изменяются. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки заключается в следующем. Пример 1. Засевают 1-2 бактериологических петли культуры бактерий штамма 10/2 на пробирки со скошенным эритрит-агаром. 3-4 суточную бруцеллезную культуру смывают физиологическим раствором, фильтруют при помощи стерильной марли, для осаждения бактериальной массы центрифугируют 5 минут при 5 тысяч об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Из осадка готовят 100 млрд. м.к./см 3 взвесь, 20953 которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30- мин. Пример 2. Для проверки инактивирующего действия 0,25 раствора формальдегида используют отмытую суспензию штамма бактерий 10/2. Контролем служит физиологический раствор(0,85 раствор хлористого натрия). К суспензии бруцелл добавляют раствор формальдегида до 0,25 и через определенные промежутки времени (10, 15, 20 30,45 мин, 1, 2 ч) делают высев бруцелл из раствора с инактивирующим агентом и физиологическим раствором на твердую питательную среду. Результаты учитывают через 3 сут выращивания в термостате при 37 С. Полученные данные приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1 инактивация бруцелл происходит уже через 30 мин после взаимодействия с 0,25 раствором формальдегида. Рост бруцелл,суспендированных в физиологическом растворе наблюдают в течение 3 сут. Полученные результаты доказывают возможность инактивации бруцелл 10/2 для приготовления диагностических препаратов 0,25 раствором формальдегида. Пример 3. Для приготовления антигенной композиции отмытые инактивированные клетки бактерий штамма 10/2 ресуспендируют в буферном разбавителе до получения 100 млрд. м.к./см 3 взвеси, добавляют 0,03 г левамизола,шуттеллируют в течение 30 мин. Пример 4. Для проверки антигенной активности антигенных композиций было создано 2 группы кроликов по 3 головы в каждой. Первой группе животных вводили 100 млрд. м.к./см 3 инактивированных 0,25 раствором формальдегида бактерий штамма 10/2 с добавлением 0,03 г левамизола Второй группе животных вводили 100 млрд. м.к./см 3 бактерий штамма 10/2. Названные дозы препаратов были приготовлены на физиологическом растворе в конечном объеме 2 см 3, после чего иннокулируемая доза каждого препарата была разделена на 2 части. Первую часть(1 см 3) вводили кроликам подкожно в районе подгрудка. Вторую часть(1 см 3) вводили одновременно с первой, но в области брюшка. Для изучения динамики антителообразования у всех животных были взяты образцы крови из ушной вены через 10, 20 и 30 дней после иммунизации. Сыворотку крови получали методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживали 30-60 минут при 20-30 С, сгустки от стенки отделяли стальной спицей, а затем пробирки выдерживали при 4-10 С. Через 2-24 часа отстоявшуюся сыворотку сливали в сухие стерильные пробирки. Образцы сыворотки исследовались на содержание бруцеллезных антител серологически в РДСК. Полученные данные приведены в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что через 10, 20 и 30 дней после иммунизации иммуногенная активность инактивированных антигенных композиций с добавлением иммуностимулятора не уступает по средним титрам при серологическом исследовании в РДСК иммуногенной активности живых бактерий штамма 10/2. Таким образом, антигенные композиции,приготовленные из инактивированных клеток бруцелл с добавлением иммуностимулятора можно применять для получения гипериммунных бруцеллезных сывороток для приготовления диагностических средств. Таблица 1 Результаты действия 0,25 раствора формальдегида на штамм 10/2 Инактивирующее воздействие Сравнительная проверка иммуногенной активности антигенных композиций Наименование Сроки исследования после иммунизации (дни) и динамика серологических Иммунизититров в РДСК,рующего 10 20 30 препарата-антиген Антигенная 5,0 53,3 3,3 66,7 3,3 106,7 композиция из штамма 10/2 Живая вакцина из 53,3 66,7 146,7 штамма 10/2 20953 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки,включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта,отличающийся тем, что в качестве посевного материала используют производственный штамм 10/2,который смывают физиологическим раствором, фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 100 млрд. м.к./см 3 взвесь бруцелл, которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30 мин,после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт.