Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L. – продуцент моноклональных антител к белковому антигену Trichophyton verrucosum

(51) 12 5/12 (2006.01) 61 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Штамм гибридных культивируемых клеток,продуцирующих моноклональные антитела к белковому антигену,получают гибридизацией иммунных лимфоцитов мыши линии ВАВ/с с клетками миеломной линии Х 63 8.653, по методу Келера и Мильштейна(1976), и используют как продуцент моноклональных антител к белковому антигену. Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител и поликлональных проводят, с использованием иммуноферментного анализа,иммуноблота и электрофореза в полиакриламидном геле. Штамм гибридных культивируемых клеток животных., - продуцирует однородный по составу, гомогенный препарат антител, которые реагируют только с белковым антигеном. Концентрация антител - 40 мкг/мл в культуральной среде. Концентрация моноклональных антител по белку, очищенных из асцитной жидкости 4 мг/мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде - 132, а в асцитной жидкости титр антител достигает -112800. Все полученные моноклональные антитела относятся к классу . Константа связывания(аффинность) моноклональных антител составляет 3,310-8 М.(72) Киян Владимир Сергеевич Кухар Елена Владимировна Куйбагаров Марат Амангельдыевич Булашев Айтбай Кабыкешович Муканов Касым Касенович(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К БЕЛКОВОМУ АНТИГЕНУ(57) Изобретение относится к биотехнологии и,может быть использовано в ветеринарии для диагностики трихофитии крупного рогатого скота, и в медицине, при диагностике зооантропонозной трихофитии, а также в микробиологии, для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды и изучения таксономии микроорганизмов. 24442 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии для диагностики трихофитии крупного рогатого скота, и в медицине,для диагностики зооантропонозной трихофитии, а также в микробиологии для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды и изучения таксономии микроорганизмов. Зоофильный грибявляется возбудителем трихофитии у крупного рогатого скота и инфильтративно-нагноительной трихофитии волосистой части головы, гладкой кожи и паразитарного сикоза у людей. Анализ эпизоотической ситуации по дерматомикозам животных в последние годы показал на появление ассоциированных заболеваний или возникновение болезни,вызванной нехарактерным видом возбудителя. Сообщается, что наряду с традиционными видами возбудителей дематомикозов, выделяются М. , . ,. ,., . , .,и(Панин А.Н. и др. Изменение спектра зооантропофильных дерматофитов, поражающих лошадей. //Успехи медицинской микологии. Под общ. ред. акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. Т.П. Мат. Первого Всероссийск. конгресса по мед. микологии. М. Нац. академия микологии. 2003. с.118-119). Имеются определенные трудности в диагностике дерматомикозов, возможны ошибки при постановке диагноза. Классические способы, используемые в диагностике трихофитии микроскопия материала,люминесцентная диагностика, посев на питательные среды и идентификация полученных изолятов грибов, - характеризуются трудоемкостью и длительностью анализов, низкой чувствительностью и специфичностью. (Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции. Руководство для врачей. 2. изд. М Издательство БИНОМ, 2008. с.35-71). В этой связи, большой практический интерес представляет внедрение в диагностику дерматомикозов животных и человека одного из самых высокочувствительных серологических способов - иммуноферментного анализа (ИФА),который с момента его внедрения в практику( Е., 1971), широко используется с применением поликлональных сывороток крови. Поликлональные антитела не всегда обеспечивают достаточную специфичность, чувствительность и воспроизводимость проводимых анализов. Использование в ИФА моноклональных антител(МКА), направленных к определенным антигенным детерминантам возбудителя трихофитии, позволит существенно повысить специфичность и воспроизводимость данного теста. Известно, что МКА обладают высокой специфичностью и активностью. Это связано с тем,что гибридомная техника производства моноклональных антител позволяет получать гомогенные препараты иммуноглобулинов,специфически взаимодействующие только с определенной антигенной детерминантой агента. Это говорит о том, что МКА можно использовать 2 при разработке высокочувствительных тест-систем,таких, как способ иммуноферментного анализа. МКА продуцируется гибридными культивируемыми клетками (гибридомами), получаемыми путем слияния иммунных лимфоцитов с миеломными(опухолевыми) клетками. (Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). Методы культивирования клеток. Л. Наука. 1987. - с.194-205). Известен ряд штаммов гибридом,продуцирующих МКА к различным антигенам. ( ,, ... 1986.23(3)609-15. /, ... 1985 21(1)138-9. / . , ,. . 46, . 4, . 1995, р.435-444.). Известны штаммы гибридных клеток с авторским названием-1,синтезирующие моноклональные антитела против фосфорилхолинового компонента антигена, полученные слиянием клеток миеломы -8 со спленоцитами мышей линии/,иммунизированных цитоплазматическим антигеном. Полученные МКА относились к классу . ( ,. 1987133(9)2699-705). Известны штаммы гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к,которые были получены от крысы,иммунизированной осадком этанольного фильтрата Т. . Гибридомы продуцировали 5 клонов МКА, которые являлись иммуноглобулинами класса М, и специфически реагировали с препаратами экзоантигена из Т. . МКА, продуцируемые данными штаммами гибридных клеток, получены к полисахаридному антигену, в частности, к экзополисахаридам Т. . (, ., , . .,//,.53. - . 1991. -р. 181-193). Наиболее близким техническим решением, по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту, (прототипом) является штамм гибридных культивируемых клеток с авторским названием 3 С 10, полученный слиянием клеток мышиной миеломы и иммунных спленоцитов к белковому антигену, который стабильно синтезирует МКА,принадлежащие к иммуноглобулинам класса , 24442 характеризующиеся показателем константы связывания, равной 5-10-7 М. (Акимбаева А.К.,Кухар Е.В., Сураншиев Ж.А., Акибеков О.С. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител,полученных к возбудителю рубромикоза.. .15-20). Штамм гибридных клеток, продуцирующий МКА к белковому антигену,предназначен для выявления возбудителя рубромикоза человека, что коренным образом отличается от предлагаемого изобретения, где полученный штамм гибридных клеток Ма/Т 3 2 ЕЗ, синтезирует МКА, предназначенные для выявления возбудителя трихофитии крупного рогатого скота и зоонозной инфильтративнонагноительной трихофитии человека. Предлагаемый штамм гибридных клеток продуцирует МКА класса, которые специфичны к белковому антигенус молекулярной массой 30 кДа,обладают преципитирующими и агглютинирующими свойствами. Эти показатели дают возможность использовать МКА данного штамма для разработки экспресс - методов диагностики трихофитии крупного рогатого скота и зоонозной трихофитии человека, на основе иммуноферментного анализа и реакции микроагглютинации. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующего моноклональные антитела к белковому антигену. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг белкового антигена клеточной стенки, полученного по методу .(1979), в 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда. На 7 день после первой иммунизации вводят 100 мкг белкового антигена, в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 14, 15, 16-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 3 дня после последней иммунизации, извлекают селезенку из тех мышей, которые дают более высокие титры антител по ИФА. Лимфоциты селезенки иммунных мышей, в количестве 20106, сливают с клетками миеломы 63-8-563 в присутствии 1 мл раствора,содержащего 45(объем на объем) полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксид в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (Г). Через 10-14 дней, после слияния, в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм, отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ИФА,с использованием белкового антигенаи кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантин-тимидин (ГТ) и полную среду-1640. Клоны клеток,продуцирующих моноклональные антитела, трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 100 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают / 3 - 2 Е 3. Штамм гибридных клеток / 3 - 2 Е 3 депонирован и хранится в Республиканской коллекции микроорганизмов РГКП Национальный центр по биотехнологии Республики Казахстан(010000, г. Астана, ул. Ш. Валиханова, 43) под регистрационным номером - 0222 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки, размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ -глютамина 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола - 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. 6 Посевная концентрация 210 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы секреция МКА достигает 40 мкг/мл в культуральной среде. Титры иммуноглобулинов в культуральной среде 132. Все,указанные в данном пункте характеристики штамма клеток, определяют методом ИФА. Характеристика полезного продукта. Моноклональные тела относятся к иммуноглобулинам класса. Константа связывания 3,310-8 М. МКА к белковому антигену дерматомицета Т. специфически реагируют с белками с молекулярной массой 30 кДа. Методы оценки специфичности МКА реакция микроагглютинации, непрямой, и сэндвич варианты ИФА. Контаминация штамма. Контаминантов в клетках, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы,с завинчивающимися крышками, по 2105 клеток, в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С, а затем переносят в жидкий азот. 3 24442 Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 70. Штамм гибридных культивируемых клеток/ 3 - 2 Е 3 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в 3 6 пластиковые матрасы, площадью 25 см по 210 клеток в 1 мл на питательные среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости,содержащей антитела. При культивировании гибридомы на мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем забуференного физиологического раствора (ЗФР), рН 7,2-7,4. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР. Пример 2. Для определения молекулярной массы белкового антигена, к которому получены МКА,проводят электрофорез и перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану с последующим иммунохимическим проявлением (иммуноблотинг). Электрофорез белка проводят в 10 полиакриламидном геле в присутствии 0,1 додецилсульфата натрия. Перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану проводят методом полусухого электроблотинга в аппарате фирмы при силе тока 18 мА на см 2 геля, в течение 2 часов. Нитроцеллюлозную мембрану используют для иммунохимического проявления антителами. Для этого нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в растворе очищенного препарата моноклональных антител, в разведении 14000, в течение 1 часа. После этого носитель инкубируют, в течение 1 часа,при 37 С с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена. Реакция проявляется субстратом, который готовят разведением 15 мг 4 хлор-1-нафтол в 3 мл этанола и добавлением 20 мл ЗФР и 25 мкл 30 раствора перекиси водорода. Результат Иммуноблотинг показал,что моноклональные антитела специфически связываются с белком, имеющим молекулярную массу 30 000 дальтон. Пример 3. Специфичность моноклональных антител проверяют в реакции микроагглютинации(РМА). В круглодонные ячейки планшета для микротитрования вносили по 0,05 мл забуференного физиологического раствора (рН 7,2-7,4). Затем в первые ячейки каждого ряда добавляли по 0,05 мл исследуемого образца в концентрации 10 мкг/мл(МКА, вырабатываемые штаммами 2 ЕЗ) и делали двукратные разведения. После этого в каждую лунку вносили по 0,005 мл белкового антигена (по) в концентрации 0,25 мг/мл, единый бруцеллезный антиген и туберкулин, встряхивали планшет и помещали в термостат при 37 С. В качестве отрицательного контроля использовали фетальную сыворотку плода коровы и сыворотку новорожденных телят, в качестве положительного гипериммунную сыворотку крови крупного рогатого скота иммунизированного антигеном гриба Т. . Учет реакции проводят визуально по общепринятой методике (в крестах), таблица 1. Таблица 1 Результаты тестирования моноклональных антител в реакции микроагглютинации с различными антигенами Антигены Обратные величины титров Показатели в специфических антител крестах 1128 Единый бруцеллезный антиген для РА и РО РСК Туберкулин РО 1128 К КРезультаты показывают, что МКА к белковому антигену гриба Т.,обладают агглютинирующими свойствами, проявляя высокую активность и специфичность в РМА. 4 Пример 4. Оптимальное разведение МКА определяют в ТИФА. Для проведения непрямого ИФА в лунки 96-луночной планшеты для иммунологических реакций вносят по 100 мкл 24442 белкового антигена Т.в концентрации от 40 до 0,3 мкг/мл. Планшет инкубируют при 4 С в течение ночи. Затем планшет отмывают и вносят по 100 мкл 1 раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) и инкубируют в течение 1 часа при 37 С. После инкубации повторяют процедуру отмывки. На раститрованный антиген вносят разведения моноклональных антител с 110 до 18000 в объеме 100 мкл в ЗФР с 0,05-ным твином-20. После инкубации в течение 1 часа при 37 С планшету отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой хрена. Через 1 ч повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Антитела против структурных белков гриба определяют количественно по расщеплению субстрата,который готовят разведением 10 мг ортофенилендиамина в 10 мл лимонной кислоты, РН - 4,5 с добавлением 10 мкл 30 раствора перекиси водорода. Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Результат Рабочее разведение моноклональных антител для постановки непрямого варианта ИФА 14000. Пример 5. Специфичность МКА определяют в ТИФА с использованием различных антигенов Для проведения ТИФА на 96 - луночный полистироловый планшет сорбируют антигены дерматомицетов, микобактерий и бруцелл в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР, рН 7,2-7,4. Инкубируют при 4 С в течение ночи или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывают 3 раза ЗФР с 0,05 ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости(КЖ) или асцитной жидкости (АЖ), начиная с разведения 1100 и выше, в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФР-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата(антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой) в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси (5 мг орто-фенилендиамина растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера, рН 4,5 и добавляют 0,025 мл 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 2 М раствора 2 О 4. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре, путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке, при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным, или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают их максимальное разведение, величина оптической плотности в котором, в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Для характеристики МКА используют белковые антигены Т.разных штаммов, белковые антигены других дерматомицетов родаи гриба, а также бактериальные антигены. Результаты опыта по определению специфичности МКАв ТИФА представлены в таблице 2. Таблица 2 Результаты тестирования моноклональных антител в реакции ТИФА с различными антигенами Виды антигенов Титры МКА Культуральная жидкость Асцитная жидкость Растворимые белковые антигены по .. (1979) 1 Т.12 132 112800 2 Т.130 116 112800 3 Т.59 14 1800 4 Т.12 1200 5 РО 1200 Другие антигены 6 Единый бруцеллезный антиген для РА и РСК РО РО 7 Туберкулин РО РО Примечание - РО - реакция отрицательная. Как видно из приведенных в таблице 1 результатов, полученные моноклональные антитела проявляют высокую активность к белковым антигенам дерматомицетов рода ,выявляя антигены Т.в более высоких титрах, которые на 1-2 порядка выше, чем титры с белковыми антигенами других дерматомицетов и не реагируют с другими видами микроорганизмов., что позволит получать на их основе эффективные диагностические препараты для индикации и дифференциации возбудителя трихофитии крупного рогатого скота. 5 24442 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных., / - 23, регистрационный номер С - 0222 - продуцент моноклональных антител к белковому антигену клеточной стенки.