Способ получения вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ получения иммуногенной, безвредной вакцины,создающий напряженный иммунитет против сальмонеллеза у водоплавающей птицы. Способ получения вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы, включающий культивирование аттенуированного штамма на питательной среде в две стадии, концентрирование полученной бактериальной массы, расфасовку и лиофилизацию, в качестве аттенуированного штамма используют штамм бактерииВ-0005, который культивируют на плотной питательной среде, затем разводят в сахарозо-желатиновой среде, доводят концентрацию микробной массы до 20 млрд м. к./см 3, фасуют,лиофилизируют и получают целевой продукт.(72) Егорова Наталья Николаевна Мусаева Асия Кыбылашевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ВОДОПЛАВАЮЩЕЙ ПТИЦЫ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к способам получения биопрепаратов против инфекционных болезней водоплавающей птицы. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке способа Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к способам получения биопрепаратов против инфекционных болезней водоплавающей птицы. Известен способ получения вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы, включающий культивирование аттенуированного штамма на питательной среде, концентрирование полученной бактериальной массы, расфасовку и лиофилизацию Инновационный патент Республики Казахстан 12827, кл. А 61 39/12, 2002. Недостатком данного способа является то, что вакцина, полученная указанным способом, для профилактики сальмонеллеза водоплавающей птицы обладает недостаточной иммуногенностью. Задачей изобретения является разработка способа получения вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы из аттенуированного штамма бактерии, позволяющего повысить иммуногенную активность вакцины и эффективность профилактики сальмонеллеза водоплавающей птицы,не обладала бы реактогенными свойствами. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке способа получения иммуногенной, безвредной вакцины,создающий напряженный иммунитет против сальмонеллеза у водоплавающей птицы. Способ получения вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы, включающий культивирование аттенуированного штамма на питательной среде в две стадии, концентрирование полученной бактериальной массы, расфасовку и лиофилизацию, в качестве аттенуированного штамма используют штамм бактерииВ-0005, который культивируют на плотной питательной среде, доводят концентрацию микробной массы до 20 млрд м. к./см 3, фасуют,лиофилизируют в сахарозо - желатиновой среде и получают целевой продукт. Штамм культурыВ-0005 депонирован в ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ). Идентификацию штамма бактерии В-0005,на основе которого изготавливается вакцина, проводят по основным биологическим свойствам(морфологическим,культуральным,биохимическим,антигенным),согласно определителю бактерий/, 2005,2,, . 764 - 799. Штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Штамм бактерииВ-0005, палочки с закругленными краями, реже овоидной формы, 24 мкм в длину и 0,2-0,4 мкм в ширину. Сальмонеллы подвижные, с перитрихиально расположенными жгутиками, легко окрашиваются анилиновыми красками, грамотрицательные. Спор и капсул не образуют. 2 Культуральные свойства. Сальмонеллы - аэробы или факультативные аэробы. Хорошо развиваются на обычных питательных средах, оптимальная температура роста 37 С, присреды 7,2-7,4. На МПБ штамм бактерииВ 0005, образует равномерное помутнение со слизистым осадком, на МПА - серовато голубоватые опалесцирующие колонии, вокруг которых иногда образуются периферические валики. При хранении культуры довольно быстро диссоциируют в- формы. На среде Эндо сальмонеллы образуют слегка розоватые прозрачные колонии на висмут - сульфитном агаре мелкие черные колонии с металлическим блеском,участки среды под колонией также окрашиваются в черный цвет на среде Плоскирева - бесцветные колонии. Для культивирования сальмонелл используют также среды накопления - селинитовую,Мюллера, Кауфмана, Киллиана. Учет характера роста необходимо проводить через 24-48 часов. Биохимические свойства. Штамм бактерииВ-0005, не изменяет инозит,глицерино - фуксиновый бульон, раффинозу,салицин образует сероводород и не образует индола. Не ферментирует мочевину, лактозу,сахарозу, не разлагает желатин. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, галактозу,маннозу, арабинозу, рамнозу, маннит, мальтозу,дульцит, сорбит, восстанавливает нитраты в нитриты. Сальмонеллы растут на агаре Симмонса(желтое окрашивание среды). Антигенная структура. У штамма бактерииВ-0005, имеются два основных антигенных комплекса О - антигена(соматический) термостабильный 1, 4, 5, 12 Н антиген (термолабильный), белковой природы 1-я фаза , 2-я фаза Н - 1,2. Штамм бактерииВ-0005 относится к серологической группе В. Штамм бактерииВ-0005 является аттенуированным вакцинным, не обладает вирулентными свойствами для утят и гусят. Штамм обладает слабой остаточной вирулентностью, его вирулентность снижена в 20 раз по сравнению с природным прототипом. За время хранения в лабораторных условиях штамм не изменил культурально - морфологические, биохимические свойства, также антигенную структуру. Штамм бактерииВ-0005,полученный из вирулентной культуры под влиянием стрептомицина с последующей селекцией и отбором клонов мутантов,отличается слабой вирулентностью, выраженными иммуногенными свойствами,отсутствием вирулентных и реактогенных свойств. Образовывает сероводород и не образовывает индола, не ферментирует лактозу и сахарозу. Существенным отличием от штамма бактерииВ-0005 от вирулентного прототипа является ауксотрофность в отношении тиамина и никотиновой кислоты штамм образует аргинин - декарбоксилазу и слабо-лизин 31134 декарбоксилазу. Вакцинный штамм не реверсирует при пассировании на восприимчивых животных(белые мыши, куриные эмбрионы). Титр сыворотки в РА 1400 - 1400. Физиологические - прототроф, хемоорганотроф,обладает дыхательным и бродильным типом метаболима. Аэроб. Серологические при типизации с диагностическими сальмонелезными сыворотками имеет постоянную реакцию с О - сывороткой 1, 4,5,12 и Н сывороткой 1-я фаза , 2-я фаза 1,2. Патогенные свойства. Штамм бактерииВ-0005 безвреден для белых мышей. При подкожном введении белым мышам массой 16-18 г в дозе 10 млн микробных клеток(0,2 см 3 50 млн взвеси суточной агаровой культуры сальмонелл) по стандартному образцу ГИСК им. Тарасевича в объеме 0,2 см 3, штамм не вызывает гибели более 2 белых мышей в течение 10 сут наблюдения. Иммуногенность для белых мышей. Штамм бактерииВ-0005 обладает выраженной иммуногенностью для белых мышей массой 16-18 граммов, защищая 100 животных при однократной подкожной иммунизации их живой вакциной из штамма в дозе 10 млн микробных клеток в объеме 0,2 см 3 и последующим подкожным заражением через 21 сутки 2,5 50 вирулентным(контрольным) штаммом 371. Выживаемость опытных животных составила 100 - 10 голов. Из 10 контрольных мышей аналогичной массы, зараженных одновременно с вакцинированными, погибли 8 животных. Срок наблюдения 10 суток. Пример 1. Питательной средой для изготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят служит бульон Хоттингера (200-250 мг аминного азота), содержащий 10 печеночного экстракта,0,4 пептона. Для приготовления питательной среды используют основной перевар Хоттингера. На 1 кг мясного фарша добавляют 1,5 дм 3 дистиллированной воды, подогретой до 40 С, и подщелачивают 20 раствором едкого натра, так чтобы концентрация водородных ионов была 7,8 8,0. Затем на каждый килограмм фарша добавляют 150-170 г измельченной поджелудочной железы или 18-20 г панкреатина и на каждый дм 3 смеси -10 см 3 хлороформа. Ферментативное расщепление должно продолжаться 5-6 сут при 40-45 С. Химические показатели качественного перевара общий азот 800 - 1200 мг аминный азот - 500-750 мгтриптофан - 100 150 мг. Содержание (мг) общего азота определяют методом перегонки Къельдаля аминного азота (мг) - формольным титрованием триптофана (мг) - методом Пешкова. Приготовление печеночного экстракта. На 400 г свежей или свежезамороженной печени к. р. с. или свиней, освобожденной от жира и пленок,измельченной на кусочки по 30-50 г, добавляют 0,5 дм 3 дистиллированной воды и кипятят в течение часа, после чего фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Приготовление питательной среды. Для приготовления питательной среды к надосадочной жидкости основного перевара Хоттингера добавляют дистиллированную воду с таким расчетом, чтобы содержание аминного азота было не менее 200-250 мг. Затем добавляют 10 печеночного экстракта. 0,4 пептона, 3-4 агара. Смесь кипятят в течение 30 минут, затем устанавливаютсреды до 7,7-7,8 путем добавления 20 едкого натра, добавляют 15 дистиллированной воды на выкипание, после чего добавляют 0,3 химически чистого хлорида натрия. После растворения указанных ингредиентов добавлением 20 едкого натра устанавливают 7,8-9,0. Среду кипятят 30 минут, отстаивают 11,5 часа, фильтруют через ватно - марлевый фильтр. Для контроля стерильности приготовленную питательную среду выдерживают термостате 72 часа при 37 С (отсутствие контаминации). Готовая питательная среда должна быть стерильной,прозрачной или слегка опалесцирующей,7,4-7,6 и содержать аминный азот 200-250 мг. Приготовление сахарозо - желатиновой среды. В кипящей дистиллированной воде растворяют 1,32,0 желатина ( 7,4-7,6), добавляют 10 сахарозы. После растворения компонентов смесь фильтруют через ватно-полотняный фильтр. Стерилизуют 20 мин при 110 С,7,0 - 7,2. Приготовление посевного материала. Для изготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы многократно используют отдельную ампулу с лиофилизированной культурой штамма В-0005. Затем проверяют морфологические, культуральные, биохимические свойства и агглютинабельность штамма бактерииВ-0005 с монорецепторными сыворотками О - , , ,и Н - , Н-1,2 производства Краснодарской биофабрики и СанктПетербургского научно-исследовательского института вакцин и сывороток и предприятия по производству бактерийных препаратов. Бактерии штаммаВ-0284 агглютинируются сыворотками О -//,//,//// Н -// 1,2//. Ампулу с сухим штаммом вскрывают и добавляют в нее 2 см 2 стерильного физиологического раствора Полученную взвесь заливают по 1 см 3 в два флакона с бульоном Хоттингера (вместимость флакона 100 см 3, объем среды - 1/3 флакона). Выращивают в термостате 14-15 часов при температуре 371,0 С(культура первой генерации). Культуру первой генерации проверяют на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Граму, типичность роста, стерильность и засевают 50 см 3 в бутыль, содержащую 10 дм 3 бульона Хоттингера(культура второй генерации). Культивирование проводят при 371,0 С 1820 часов. Культура второй генерации служит посевным материалом для получения в последующем биомассы. Выращенную и проверенную на чистоту суточную матриксную культуру второй генерации с 3 соблюдением условий стерильности засевают в бутыли со стерильной питательной средой,охлажденной до 37-30 С из расчета 5-10 матриксной расплодки к общему объему питательной среды, одновременно добавляют 0,1(в перерасчете на сухое вещество) стерильного 40 раствора глюкозы 5-10. Культуру, засеянную в бутыли, выращивают 1820 часов при (371,0)С с постоянным перемешиванием и непрерывной аэрации при(371,0)С. В процессе выращивания культуры через 5-6 часов после засева берут пробу для определения , чистоты роста и концентрации микробных тел. Добавляют 40 раствор глюкозы и продолжают выращивать еще в течение 4 - 6 часов. Выращенную культуру проверяют на чистоту популяции путем микроскопии и высева в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, агар Сабуро, на чашки Петри с МПА. Культура должна агглютинироваться монорецепторными сыворотками О - , ,и Н-,. После получения результатов,подтверждающих отсутствие загрязнения посторонней микрофлорой выращенной культуры (просмотр посевов, микроскопия),производят определение концентрации микробных тел по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Микробную массу хранят при температуре от 2 до 4 С 1-1,5 суток. Культура сальмонелл должна иметь концентрацию 20 млрд микробных клеток в 1 см 3 и 7,2 - 7,4. Бактериальную суспензию, разведенную средой для лиофилизации до концентрации 20 млрд 1,0 млрд микробных клеток в 1,0 см 3 по оптическому стандарту мутности, расфасовывают по 4,0 см 3 в стерильные ампулы. Погрешность расфасовки 1. После этого ампулы с вакциной подвергают лиофильной сушке и запаивают под вакуумом. Пример 2. Контроль вакцины сухой живой против сальмонеллеза водоплавающей птицы. Физико-химические и биологические свойства. Внешний вид Сухая мелкопористая масса белого или серовато-желтого цвета Внешний вид, цвет,наличие посторонней примеси, плесени, трещин ампул проверяют визуально. Одновременно проверяют прочность запайки ампул, упаковку и правильность нанесения маркировки. Вакуум в ампулах Наличие вакуума в ампулах определяют с помощью аппарата типа дАрсонваль или Тесла. В ампулах с сухой вакциной должен быть вакуум. Фиолетово-яркое свечение,сопровождающееся характерным потрескиванием при проверке аппаратом дАрсонваля. Растворимость При добавлении в ампулы с вакциной физиологического раствора или воды,равном объему до высушивания, сухая масса должна полностью раствориться в течение 2-5 мин,образуя гомогенную взвесь белового или сероватожелтого цвета без хлопьев, комочков, осадка. Для проведения испытаний используют три ампулы с сухой вакциной, в которые после их вскрытия вносят физиологический раствор в объеме,равном объему вакцины до высушивания (по 4 см 3). 4 Содержимое ампул после встряхивания должно полностью ресуспендироваться в течение (2-5) мин. Массовая доля влаги Массовая доля влаги должна быть не более 3. Концентрации водородных ионовКонцентрации водородных ионовв вакцине определяют потенциометром -121 или другим прибором того же класса точности, предварительно растворив препарат. Количество микробных клеток в 1,0 см 3 по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича 20 млрд м.к./см 3. Количество живых сальмонелл в 1,0 см 3, млрд 810 млрд живых м.к./см 3 Стерильность Стерильной считается вакцина не контаминированная посторонней микрофлорой и грибами (плесенью). Не допускается следов оттаивания, трещин ампул. Типичность роста культуры Посевы выдерживают в течение 10 сут и ежедневно просматривают визуально на типичность роста сальмонеллезной культуры штаммаВ-0005, на МПА и среду Эндо на чашках Петри - 1 сут при температуре (371)С. Пробирки с посевами на среде Сабуро выдерживают 10 сут при температуре (20-22)С. На питательных средах должен быть типичный рост вакцинного штамма бактерииВ-0005 однородные грамотрицательные палочки, на среде Сабуро не должно быть роста плесени. Роста посторонней микрофлоры не допускается. В посевах вакцины в МПБ должен быть характерный рост сальмонеллезной культуры штамма бактерииВ-0005 в виде равномерного помутнения пробирки или флакона со средой. Недопустим рост с образованием пленки, помутнением среды, через 24 часа образуется осадок. На поверхности МПА должен быть рост культуры штамма бактерииВ-0005 в виде полупрозрачных,голубоватых колоний -формы, диаметром 2-4 мм. На среде Эндо через (6-18) ч культивирования вырастают бесцветные полупрозрачные выпуклые колонии. Определение количества микробных клеток в 1,0 см 3 Вакцину в ампулах (флаконах) разводят до первоначального объема стерильным физиологическим раствором,смешивают содержимое двух ампул в одной пробирке и определяют количество сальмонелл в 1,0 см 3 по стандартному образцу мутности ГИСК им. Тарасевича. Оно должно соответствовать (201) млрд микробных клеток в 1,0 см 3. Определение количества живых сальмонелл Для определения количества живых микробных клеток готовят две пробы, каждая из которых состоит из двух ампул с вакциной. Вакцину в ампулах разводят до первоначального объема стерильным физиологическим раствором,смешивают содержимое двух ампул в одной пробирке и определяют количество сальмонелл в обеих пробах по стандартному образцу мутности ГИСК им. Тарасевича. Она должна соответствовать 201 млрд микробных клеток в 1,0 см 3. Из обеих проб методом десятикратных разведений отдельными пипетками готовят разведения 10-7 и 10-8. Из каждого разведения обеих проб делают высевы на МПА на 3 чашки Петри. Чашки с посевами помещают в термостат при температуре 37-38 С на 24-36 ч, после чего подсчитывают количество колоний по каждому разведению. Полученные показатели суммируют и делят их на количество чашек, определяют среднее количество живых бактерий для каждого разведения,содержащееся в 0,1 см 3. Затем средние показатели по каждому разведению увеличивают в 10 раз,получая количество микробных клеток 1,0 см 3 данного разведения. После этого добавляют столько нулей, каков показатель разведения вакцины,получая концентрацию микробных клеток 1,0 см 3 по каждому разведению. Среднюю концентрацию микробных клеток в 1,0 см 3 выводят, сложив результаты дух взятых разведений и разделив их на два. Количество живых сальмонелл по отношению к содержанию их в стандартном образце должно быть не менее 40 (8 млрд в 1 см 3). Количество доз вакцины устанавливают путем деления показателя живых сальмонелл в 4 см 3 на 1 млрд живых микробных клеток. Иммунизирующая доза для водоплавающей птицы соответствует 1 млрд живых микробных клеток. Определение безвредности Сущность метода заключается во введении вакцины в дозе 10 млн микробных клеток в объеме 0,2 см 3 лабораторным животным. Для испытания используют 3 ампулы вакцины,разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 50 млн микробных клеток в 1,0 см 3. В каждую ампулу вносят стерильный физиологический раствор в объеме, равном объему до высушивания. Растворенную вакцину вакцину из ампул переносят в стерильную пробирку и из общей массы готовят разведение ее на стерильном физиологическом растворе с концентрацией 50 млн микробных клеток в 1,0 см 3. Безвредность каждой серии вакцины проверяют на 10 белых мышах массой 16-18 г, которым вводят вакцину внутрибрюшинно в дозе 10 млн микробных клеток в объеме 0,2 см 3. Вакцина считается безвредной, если не вызывает гибели более 2 белых мышей в течение 10 сут наблюдения. Допускается у привитых лабораторных животных слабое угнетение на 12 сут, которое нормализуется на 3-4 сут. Определение иммуногенности Вакцину из смеси трех ампул разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 50 млн микробных клеток в 1,0 см 3. Для определения иммуногенной активности обирают 20 белых мышей массой 16-18 г, из них 10 белым мышам вакцину вводят подкожно в область спины в дозе 10 млн микробных клеток в объеме 0,2 см 3. Через 20 сут 10 иммунизированных и 10 контрольных белых мышей заражают подкожно в дозе 2,5 50 (2,5 млн м. к.) вирулентной культурой контрольного штамма 371. Смертельную дозу контрольного штамма определяют титрованием на белых мышах массой 16-18 г. Вакцину считают активной при выживании 8 опытных белых мышей и гибели 8 контрольных белых мышей в течение 10 суток. Наблюдение за животными ведут в течение 5 суток после гибели восьмой контрольной белой мыши. Вакцина считается иммуногенной, если 8 из 10 опытных(привитых) и гибели не менее 8 из 10 контрольных(не привитых) белых мышей. Срок наблюдения - 10 сут. Апробация вакцины сухой живой против сальмонеллеза водоплавающей птицы в неблагополучных по данной инфекции фермерских хозяйствах Алматинской области показала, что препарат является безвредным, ареактогенными и иммуногенно активным для утят. Профилактическая эффективность составляет 90-95. Вакцину применяют однократно утятам и гусятам 34 дневного возраста в дозе 1 млрд живых микробных клеток путем выпаивания. Срок годности вакцины 1 год со дня изготовления. Предложенный способ позволит получить вакцину на основе штамма бактерии В-0005,обладающую высокой иммуногенностью,безвредностью и эффективностью для профилактики сальмонеллеза водоплавающей птицы. Применение вакцины, изготовленной данным способом, позволит профилактировать сальмонеллез у утят и гусят,значительно сократить экономический ущерб вследствие увеличения поголовья водоплавающей птицы. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы,включающий культивирование аттенуированного штамма на питательной среде в две стадии,концентрирование полученной бактериальной массы,расфасовку и лиофилизацию,отличающийся тем,что в качестве аттенуированного штамма используют штамм бактерииВ-0005, который культивируют на плотной питательной среде, затем разводят в сахарозо-желатиновой среде, доводят концентрацию микробной массы до 20 млрд м. к./см 3 , фасуют, лиофилизируют и получают целевой продукт.