Способ фаготерапии бруцеллеза животных

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ пенициллином путем последовательных пересевов указанной культуры бруцелл на жидких питательных средах с постепенно увеличиваемыми концентрациями антибиотика до перехода бруцелл в лизогенное состояние, после чего бульонную лизогенную культуру бруцелл подвергают фильтрации через керамический фильтр с диаметром пор 100-150 нм и в фильтрате определяют наличие фага нанося 1 каплю фильтрата на газон с индикаторными культурами бруцелл,затем проводят очистку и концентрирование фагосодержащей жидкости в диализных мешочках,концы мешочков завязывают и переносят в кювет и в них засыпают полиэтиленгликоль - 6000 из расчета 15 к общему объему фагосодержащей жидкости,после чего выдерживают при температуре 20 С до полного выхода из диализного мешка жидкой части суспензии, при этом оставшийся в мешочке концентрированные сгустки бактериофага смывают бульоном Мартена в соотношении 201, увеличивают титры фага до 1050 и очищают взвесь концентрированного фага от примесей, далее полученный целевой продукт вводят подкожно морским свинкам в дозе 2,0 см 3 в область паха.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Оспанов Ержан Калиолдинович Мырзалиев Ахан Жакангерович Шманова Балымзия Тастановна Адамбаева Акмарал Ауелхановна Тспанлы Оралан(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ФАГОТЕРАПИИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности, к применению бруцеллезных штаммов бактериофагов для изготовления препарата против бруцеллеза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в широком спектре литического действия и высокой биологической активностью препарата при его использовании против больных бруцеллезом животных. Способ фаготерапии бруцеллза животных,включающий подкожное введение бактериофага,штамм Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности, к применению бруцеллезных штаммов бактериофагов для изготовления препарата против бруцеллеза животных. Известен способ фаготерапии бруцеллеза животных, включающий подкожное введение бактериофага Предварительный патент Республики Казахстан 7726, кл. А 61 35/76, 1999. Недостатком известного способа является не высокая терапевтическая эффективность препарата. Задачей изобретения является получение эффективного вирулентного бактериофага для терапии больных бруцеллезом животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в широком спектре литического действия и высокой биологической активностью препарата при его использовании против больных бруцеллезом животных. Способ фаготерапии бруцеллза животных,включающий подкожное введение бактериофага,штамм 54 индуцируют пенициллином путем последовательных пересевов указанной культуры бруцелл на жидких питательных средах с постепенно увеличиваемыми концентрациями антибиотика до перехода бруцелл в лизогенное состояние, после чего бульонную лизогенную культуру бруцелл подвергают фильтрации через керамический фильтр с диаметром пор 100-150 нм и в фильтрате определяют наличие фага нанося 1 каплю фильтрата на газон с индикаторными культурами бруцелл,затем проводят очистку и концентрирование фагосодержащей жидкости в диализных мешочках,концы мешочков завязывают и переносят в кювет и в них засыпают полиэтиленгликоль - 6000 из расчета 15 к общему объему фагосодержащей жидкости,после чего выдерживают при температуре 20 С до полного выхода из диализного мешка жидкой части суспензии, при этом оставшийся в мешочке концентрированные сгустки бактериофага смывают бульоном Мартена в соотношении 201, увеличивают титры фага до 10-50 и очищают взвесь концентрированного фага от примесей, далее полученный целевой продукт вводят подкожно морским свинкам в дозе 2,0 см 3 в область паха. Изобретение осуществляют следующим образом. Пример. Специфически бруцеллезный фаг выделяют из штамма 54, используя индуцирующий фактор пенициллин, и определяют активность по отношению к различным штаммам бруцелл. Для этого культуру бруцелл штамма 54 выращивают в жидкой питательной среде с последовательно увеличиваемыми концентрациями пенициллина от 10 до 3000 и более ЕД. антибиотика в 1,0 см 3 среды, до перехода бактерий в слизистое состояние. Затем культуру бруцелл инкубируют в питательном бульоне без антибиотика при 37 С,спустя 3-4 суток бульонную лизогенную культуру бруцелл подвергают фильтрации через керамический фильтр с диаметром пор 100-150 нм и 2 в фильтрате определяют наличие фага, нанося каплю фильтрата на газон с индикаторной культурой вакцинного штамма 19. В результате у штамма 54 появляются свойство продукции специфического фага. При этом первоначальный титр фага бывает низким, лизис вакцинного штамма . 19 наблюдают в разведении 10-2 и 10-4 или при нанесении на газон с бруцеллами нативного фага,пассирование поднимает его предельные титры до 10-6-10-12. Далее оценивают спектр литической активности бактериофага по его способности лизировать различные штаммы бруцелл на твердых питательных средах, в качестве индикаторных,используют штаммы . 19, 960, 82, 544. 16, -12, 565 . 1330, . 10/2,63/290 . 1066. Из них штаммы 19, 544, 16,565, 1330 относятся к -форме 82 -и 960, Н 12,10/2, 63/290, 1066 к- форме. Фаг, выделенный из штамма . 54 образует негативные колонии на всех взятых в опыт штаммах бруцелл разных видов и форм, в отличие от референтного фага Тб, образующего негативные колонии только на штаммах . и .,находящихся в -форме. Далее осуществляют репродукцию бактериофага на жидких питательных средах по методике Л Ляпустина. Готовят взвесь культуры штамма . 19 концентрацией 109 КОЕ/см 3 в бульоне Мартена,дополнительно содержащем сернокислый кальций и магний в концентрации 10-2-10-3 М каждой. Взвесь выращивают при 37 С в течение 5-6 часов, затем смешивают 0,1 см 3 взвеси и 0,1 см 3 бруцеллезного бактериофага с концентрацией 10-7-10-6 БОЕ/см 3(множественность инфекции 0,01-0,001). Смесь выдерживают при 37 С 20-30 минут, после чего переносят в 100 см 3 бульона Мартена и выращивают в течение 24-36 часов при 37 С. Центрифугируют 20 минут при 8000 об/мин, фильтруют через керамический фильтр и в фильтрате определяют титр фага путем нанесения капли последовательно разведенного фильтрата на газон с индикаторной культурой - штамм . 19. Затем чашки Петри с посеянной индикаторной культурой помещают в термостат при 37 С на 3-4 суток. Через указанный период просматривают посевы и устанавливают титр фага. Концентрация полученного бактериофага составляет 5-8 10-10 БОЕ/см 3. Для получения более концентрированного бактериофага исходный фагосодержащий материал в количестве 50,0-100,0 см 3 вносят в диализный мешочек, концы завязывают, затем переносят в кювет и в не засыпают полиэтиленгликоль - 6000 из расчета 15 к общему объему фагосодержащей жидкости, после чего выдерживают при комнатной температуре до полного выхода из диализного мешка жидкой части суспензии, при этом оставшийся в мешочке концентрированные сгустки бактериофага смывают бульоном Мартена в соотношении 201 соответственно и используют в качестве целевого продукта. При концентрации бактериофагов по указанному способу удается получить 50 кратные фаговые концентраты. Полученный препарат бактериофага вводят подкожно, в дозе 2 см 3 морским свинкам,зараженным 10 - кратной инфицирующей дозой шт. В.565-100 м.к. и шт. В.54 - 50 м.к. Выздоровление наступает на третий месяц от начала введения фага. При бактериологическом исследовании органов морских свинок 1 группы,зараженных штаммом В. 565,с последующей инъекцией вирулентного фага выделение культуры заражающего штамма не отмечено. Морские свинки на 100 противостояли заражению 10-кратной инфицирующей дозе. В контрольной группе морских свинок индекс инфицированности составила 33,3,у них наблюдалась генерализованная форма инфекции. От них выделено 15 культур бруцелл. При бактериологическом исследовании органов морских свинок, зараженных штаммом . 54,с последующей инъекцией вирулентного фага также не отмечено выделение культуры заражающего штамма. В контрольной группе морских свинок индекс инфицированности составил 27, у них наблюдалась генерализованная форма инфекции. От них выделено 17 культур бруцелл. Исследования проведенные на морских свинках,доказывают наличие высокой антибактериальной активности у выделенного фага против бруцелл наиболее патогенных видов, вызванным штаммами В. и Поэтому применение вирулентного фага с терапевтической целью в ветеринарной практике имеет чрезвычайно большое значение при купировании инфекции и предотвращении абортов бруцеллезной этиологии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ фаготерапии бруцеллза животных,включающий подкожное введение бактериофага,отличающийся тем, что штамм 54 индуцируют пенициллином путем последовательных пересевов указанной культуры бруцелл на жидких питательных средах с постепенно увеличиваемыми концентрациями антибиотика до перехода бруцелл в лизогенное состояние, после чего бульонную лизогенную культуру бруцелл подвергают фильтрации через керамический фильтр с диаметром пор 100-150 нм и в фильтрате определяют наличие фага нанося 1 каплю фильтрата на газон с индикаторными культурами бруцелл, затем проводят очистку и концентрирование фагосодержащей жидкости в диализных мешочках, концы мешочков завязывают и переносят в кювет и в них засыпают полиэтиленгликоль - 6000 из расчета 15 к общему объему фагосодержащей жидкости, после чего выдерживают при температуре 20 С до полного выхода из диализного мешка жидкой части суспензии, при этом оставшиеся в мешочке концентрированные сгустки бактериофага смывают бульоном Мартена в соотношении 201,увеличивают титры фага до 10-50 и очищают взвесь концентрированного фага от примесей, далее полученный целевой продукт вводят подкожно морским свинкам в дозе 2,0 см 3 в область паха.