Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. Mab/PVX-2F9 продуцент моноклональных антител к Х-вирусу картофеля

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Штамм гибридных культивируемых клеток/-29, продуцирующих моноклональные антитела к Х-вирусу картофеля получали гибридизацией иммунных лимфоцитов мыши линии/ с клетками миеломной линии 638.653 по методу Келера и Мильштейна (1976). Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител проводили с использованием непрямого варианта иммуноферментного анализа и методом иммуноблотинга. Штамм гибридных культивируемых клеток животных., /-29 продуцирует однородный по составу гомогенные препараты моноклональных антител, которые высокоспецифичны к Х-вирусу картофеля . Титры моноклональных антител секретируемые штаммом гибридомы составляют в ИФА в культуральной жидкости 1256, в асцитной жидкости 1204800. Концентрация белка в культуре клеток составляет 125 мкг/мл, в асцитной жидкости- 8 мг/мл. Синтезируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела относятся к классу ,подклассу 1. Константа связывания (аффинность) моноклональных антител составляет 2,51010 М-1.(72) Ескендирова Сауле ЗиядиновнаВарицев Юрий АлексеевичСарина Нургуль Искаковна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ/-29 ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К Х-ВИРУСУ КАРТОФЕЛЯ(57) Штамм гибридных культивируемых клеток животных., /-29 продуцент моноклональных антител к Х-вирусу картофеля . Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано растениеводстве для разработки методов диагностики Х-вирусной болезни картофеля, а также в вирусологии растений для идентификации Х-вируса картофеля. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в растениеводстве для разработки методов диагностики Х-вирусной болезни картофеля, а также в вирусологии растений для определения Х-вируса картофеля. Х-вирус картофеля (ХВК) широко распространен во всем мире и относится к числу наиболее вредоносных агентов поражающих культуру картофеля. Инфицирование ХВК рассматривается как существенный фактор, который может уменьшить урожай картофеля более чем на 25-30. Диагностика и идентификация вирусов является важным элементом в сфере защиты растений от болезней. Современные системы ведения семеноводства картофеля на оздоровленной безвирусной основе предусматривают проведение диагностического контроля вирусного поражения на различных этапах семеноводческого процесса с целью своевременного удаления инфицированных партий посадочного материала. Поэтому своевременная диагностика вирусных заболеваний является ключевым звеном для фитосанитарного мониторинга и фитосанитарной селекции, для сертификации посадочного материала и для карантинных мероприятий В настоящее время для массовой диагностики вирусных заболеваний растений используется преимущественно твердофазный ИФА в его планшетном варианте, где в качестве основного иммунореагента применяют поликлональные антисыворотки,полученные иммунизацией кроликов очищенными вирусными препаратами. Серьезную проблему при применении антисывороток для идентификации и количественного определения антигенов в различных областях исследований представляют воспроизводимость, неспецифическое связывание и перекрестная реактивность антител. Разработка диагностикумов нового поколения стала возможной на основе использования достижений современной биотехнологиигибридомной технологии, позволившей получать моноклональные антитела (МКА), идентичные по всем параметрам, взаймодействующие с уникальной детерминантой антигена и доступные в неограниченном количестве. В настоящее время моноклональные антитела как иммунореагенты используются в диагностике многих бактериальных и вирусных болезней растений. МКА по специфичности и чувствительности обнаружения патогена в биологических жидкостях значительно превосходят поликлональные антисыворотки. В литературе описано получение 10 штаммов гибридом - продуцентов моноклональных антител к Х-вирусу картофеля ( .,..// . . .-1986.-.67.-.57-67.). Штаммы гибридом получены в результате гибридизации спленоцитов крыс линии /,иммунизированных изолятами Х-вируса картофеля( и НВ) и миеломных клеток 31.2.3. Для характеристики специфичности гибридом были использованы 33 изолята Х-вируса картофеля,2 различающихся по степени патогенности и географической распространенности (Южная и Северная Америка, Европа). МКА девяти штаммов гибридом реагировала с 33 изолятами Х-вируса картофеля с различной активностью. Титры МКА в культуральной жидкости варьировали от 116 до 14096. Лишь одна гибридома МКАС 67 специфически взаимодействовала только с двумя изолятами - вируса (НВ и СР), имеющих географическое распространение только в регионе Южной Америки. Таким образом, диагностическая значимость МКА 67 обусловлена его использованием при проведении диагностических мероприятий по оздоровлению только местных сортов картофеля. Кроме того, представляет большую проблему препаративная наработка МКА на крысах, малоиспользуемых в гибридомной технологии и лабораторной практике ввиду их агрессивности и трудоемкости манипуляции. Известны мышиные МКА, полученные к Русскому штамму Х-вируса картофеля в результате гибридизации спленоцитов /с миеломной линией( .,.,.,.,.// . . .-198869.-.1799-1807). Авторами были отобраны и охарактеризованы 3 штамма высокоспецифичных гибридом - 21 ХВ 4, 212 и 23 ХА 5. Испытуемые МКА взаимодействовали со всеми использованными для тестирования изолятами Хвируса, распространенных на территории СССР, и не вступали в перекрестную реакцию с -,-,Мвирусами картофеля и вирусом табачной мозаики. Уровень чувствительности испытуемых МКА в сэндвич ИФА достигала 10-20 нг/мл. Показатели константы связывания(аффинности) МКА составили для 21 ХВ 4 - 1,510-10 М, 212 - 1,2 х 10-9 М и 23 ХА 5 -1,0 х 10-9 М, что определило их диагностическую эффективность при детекции Хвируса в листьях и клубнях зараженных и здоровых растений картофеля. Глобализация сельского хозяйства в последние десятилетия, расширение международного обмена семенным и посадочным материалом способствовали интродукции вирусов картофеля в новые регионы. Высокая изменчивость вирусов в природе в результате генетической рекомбинации и мутации под влиянием биолого-экологических факторов также способствовала образованию новых более агрессивных изолятов и ослаблению свойств известных изолятов. Современные подходы идентификации новых изолятов основаны не только на комплексе классических методов вирусологии, но и на методах молекулярной биологии, поскольку все фенотипические особенности изолятов генетически детерминированы. В настоящее время российскими исследователями идентифицированы множество новых патогенных некротических изолятов Хвируса картофеля, к числу которых относится изолят-Красавчик. Данный изолят используется в качестве иммуногена для получения поликлональных антител к Х-вирусу картофеля основного иммунореагента при производстве иммуноферментных диагностических наборов для обнаружения вирусов картофеля(НИИ картофельного хозяйства им.Лорха, п. Коренево,Московская область), широко используемого для лабораторной диагностики в регионе стран СНГ. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток,продуцирующего высокоаффинные моноклональные антитела к высокопатогенному изоляту Х-вируса картофеля для использования в качестве иммунореагента при производстве иммуноферментных диагностических тест-систем. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 25 мкг очищенного препарата Х-вируса картофеля (изолят-Красавчик), в 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда. Смесь взбивают до образования творожистой массы. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 25 мкг очищенного препарата Х-вируса картофеля в забуференном физиологическом растворе (ЗФР),7,2-7,4. Спустя 3 дня после последней иммунизации спленоциты мышей, которые дают более высокие титры антител по ИФА используют для гибридизации. Гибридизацию проводят добавлением 1-го мл раствора, содержащего 45 полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксида и 45 -1640 к смеси состоящей из 4107 миеломных клеток -63.-8 5.6.3. и 4106 иммунных спленоцитов в течение 1 минуты. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96 луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом твердофазного ИФА с использованием очищенного препарата -вируса картофеля и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантин-тимидин (ГТ) и полную среду-1640. Клоны клеток,продуцирующих моноклональные антитела, трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 90 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают /-29. Штамм гибридных клеток /-29 депонирован и хранится в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов (010000, г. Астана,ул. Ч. Валиханова,13/1) под регистрационным номером 0641 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола - 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия- 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2105 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. При внутрибрюшинном введении сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 14-16 день. Доза клеток при прививке 2105 клеток. За 14 дней до введения гибридомы мышам вводят внутрибрюшинно 2,6,10,14 тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 4 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения). Продуктивность штамма. На 5 день культивирования гибридомы, концентрация МКА достигает 125 мкг/мл в культуральной среде, а при прививке сингенным мышам (в асцитной жидкости)- 8 мг/мл. Титр МКА иммуноглобулинов в культуральной среде составляет 1256, а в асцитной жидкости 1204800. Характеристика полезного продукта. Синтезируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела относятся к классу ,подклассу 1. Константа связывания(аффинность) моноклональных антител по отношению к - вирусу картофеля составляет 2,5 х 1010 М-1. Методы оценки специфичности МКА непрямой вариант ИФА, иммуноблотинг. Контаминация. Контаминантов в клетках включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С, а затем переносят в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят в стерильную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640, отмывают один раз и засевают в ячейки 24-луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Штамм гибридных культивируемых клеток Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы площадью 25 см 2 по 2 х 105 клеток в 1 мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 800 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости,содержащей антитела. При культивировании гибридомы на сингенных мышах, иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М забуференного физиологического раствора (ЗФР),- 7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР. Пример 2. Для проведения непрямого ИФА в лунки 96-луночного планшета для иммунологических реакции вносят суспензию очищенного вирусного препарата Х-вируса картофеля (изолят -Красавчик) в концентрации 0,001 мг/мл, в 0,1 мл ЗФР,7,2-7,4 и выдерживают при - 4 С в течение ночи. Планшет отмывают 3 раза ЗФР, содержащим 0,1 твина -20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР, и в каждую лунку вносят по 0,1 мл 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ЗФРТв для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 С содержимое лунок удаляют и планшет отмывают вышеописанным способом. В лунках двух вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости (КЖ) (12 и более) и асцитной жидкости(1100 и более) в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФРТв. Планшет инкубируют в термостате при 37 С в течение 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата - антител кролика против иммуноглобулинов мышей, меченные пероксидазой хрена, в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Наличие антител против Х-вируса картофеля определяют количественно по расщеплению субстрата в присутствии хромогена ортофенилендиамина. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают ее максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в непрямом варианте ИФА представлены в таблице 1. Таблица 1 Изучение специфичности и активности МКА штамма гибридомы /-29 Виды антигенов Очищенный вирусный препаратОчищенный вирусный препарат 0 Очищенный вирусный препаратОчищенный вирусный препаратОчищенный вирусный препаратОчищенный вирусный препаратПримечание РО - реакция отрицательная Титры моноклональных антител в культуральной жидкости В асцитной жидкости Растворимые антигены 1256 1204800 РО РО РО РО РО РО РО РО РО РО Как видно из таблицы, по результатам непрямого ИФА титры моноклональных антител /-29 к очищенному вирусному препаратусоставили в культуральной жидкости 1256 и в асцитной жидкости 1204800, что свидетельствует о иммунодоминантности выявляемого эпитопа капсидного белка Х-вируса картофеля. МКА гибридных клеток /-29 имея высокую специфичность по отношению к - вирусу картофеля , не вступали в перекрестную реакцию с другими вирусными препаратами - О ,и . Пример 3. Изучение специфичности МКА методом иммуноблотинга осуществляют путем переноса электрофореграммы очищенного препарата Х-вируса картофеля из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану с последующим иммунохимическим проявлением специфического антигена с помощью МКА методом непрямого ИФА. Электрофорез очищенного препарата Х-вируса картофеля проводят в 12 полакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) на аппарате для вертикального электрофореза, -,США. Электрофоретический перенос антигенов из геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляют с помощью аппарата для иммуноблотинга , -,США) при постоянной силе тока 0,8 мА/см 2 в течение одного часа. Для иммунохимического проявления нитроцеллюлозная мембрана последовательно инкубируется в 1 растворе БСА, в рабочем разведении МКА и антивидовых антител. Иммунохимическое проявление реакции проводят по расщеплению субстрата- 4-хлор-нафтола. структуры гена, составляет 25 кДа. Известно, что белок оболочкипри проведении электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях ведет себя аномально. Аномальное поведение белка связано с большим содержанием серина и треонина в концевом участке, что приводит к меньшему связыванию си определению завышенного количества молекулярной массы белка до 27-28 кДа. Таким образом, результаты иммунохимической характеристики моноклональных антител /29 свидетельствуют о их специфичности к эпитопу капсидного белка Х-вируса картофеля, что обуславливает возможность их использования как высокочувствительных и специфичных реагентов для разработки иммуноферментных диагностикумов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Фиг.2. Результаты иммуноблотинга моноклональных антител штамма гибридомы/-29 к эпитопу капсидного белка Х-вируса картофеля доказана методом иммуноблотинга. Анализ белка нативного препарата электрофорезом в ПААГ в присутствиипоказал наличие двух белковых полос. Молекулярная масса белка оболочки , исходя их первичной Штамм гибридных культивируемых клеток животных. /-29 продуцент моноклональных антител к Х-вирусу картофеля , депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов под регистрационным номером 0641,используемый для разработки методов диагностики Х-вирусной болезни картофеля, а также в вирусологии растений для идентификации Х-вируса картофеля.