Вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота

(51) 61 39/018 (2006.01) 61 31/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Казахстанского штамма, среду Лейбович и желатин при следующем соотношении компонентов, мас. сыворотка крови новорожденных телят 15-200,01-0,012 стрептомицина сульфат 0,01-0,012 микостатин 0,001-0,0012 200 М -глутамина 0,001-0,0012 антиген штамма 4,5-5,5106 клеток в 1 мл желатин 1-1,05 среда Лейбович остальное. Предлагаемая вакцина обладает высокой профилактической эффективностью при его применении против тейлериоза крупного рогатого скота по сравнению с вакциной по прототипу.(54) ВАКЦИНА ПРОТИВ ТЕЙЛЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии и микробиологии, в частности, к изготовлению вакцины для специфической профилактики тейлериоза крупного рогатого скота и способу ее получения. Вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота, содержит сыворотку крови новорожденных телят,, стрептомицина сульфат,микостатина,-глутамина,антиген Южно 30761 Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии и микробиологии, а именно к изготовлению вакцины для специфической профилактики тейлериоза крупного рогатого скота и способу ее получения. Задачей изобретения является создание высокоиммунной вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота из эпизоотически актуального аттенуированного штамма, выделенного в условиях южного Казахстана и удобным ее в применении. Эта вакцина безопасна для всех пород и во всех возрастных группах крупного рогатого скота, даже включая новорожденных телят и беременных коров,а также обладает способностью защищать вакцинированных животных от тейлериоза жвачных животных. Породы крупного рогатого скота и молодые телята южных районов в высокой степени подвержены тейлериозу жвачных животных,который представляет собой крайне опасное заболевание крупного рогатого скота, передаваемое клещами. Это заболевание неблагоприятно воздействует на рабочие свойства быков, племенные качества быков и молочную продуктивность коров,приводя к огромным экономическим потерям. Наряду с прямыми потерями, большие расходы также идут на лечение заболевших животных. Возникновение этого заболевания является сезонным, в течение лета и дождливых месяцев, т.е. с апреля по октябрь. Соответствующими признаками болезни являются лимфоаденопатия,лихорадка, анемия, слабость, лежачее положение и специфичная особенность,связанная с непрерывным потреблением пищи и жеванием,проявляющаяся у пород крупного рогатого скота до поздних стадий заболевания. Наблюдаемыми необычными признаками являются гемоглобинурия и кожная сыпь, главным образом у взрослых особей крупного рогатого скота, а также выступающие глазные яблоки и вовлечение в патологический процесс головного мозга у телят. Диагноз подтверждается демонстрацией макрошизонтов в мазках при биопсии лимфатических узлов и пироплазм в эритроцитах. Уровень заболеваемости приближается почти к 100 процентам, а уровень смертности - к 6080 процентам. В основном от этого заболевания страдают молодые животные, главным образом моложе 2-месячного возраста. Впоследствии животные продолжают получать повторяющиеся природные инфекционные инокуляты через повторяющиеся клещевые инвазии и остаются иммунными к этому заболеванию и устойчивыми даже к вирулентным провокациям. Однако в результате любого стресса,такого как беременность, роды, лактация, интеркуррентное заболевание и т.д., во время последующей жизни остаточная инфекция в их организме может перерасти в заболевание с клинической симптоматикой. Различные химиотерапевтические агенты,подобные беренилу,имидокарбу,лактатугалофугинона, бупарваквону, наряду с 2 поддерживающей терапией были испробованы с различными уровнями успешного исхода. Из этих данных было обнаружено, что бупарваквон является наиболее эффективным в лечении клинических случаев тейлериоза. Однако это лекарственное средство необходимо импортировать и оно является очень дорогостоящим. Время от времени с различным успехом были испробованы различные способы иммунизации. Эти способы иммунизации включают в себя лучевую обработку,неспецифическую иммунизацию,клеточную культуральную вакцину и т.д. Клеточная культуральная вакцина в настоящее время опробована в некоторых странах, тогда как другие способы были использованы в прошлом и имели их собственные преимущества и недостатки. Существующий на рынке продукт под названием- не рекомендуется ни телятам моложе 2 месячного возраста, ни беременным коровам. Несмотря на то,что эпидемиологические исследования подтвердили, что это заболевание встречается в первую очередь у этого поголовья скота. В патенте 2914813 описана живая вакцина против тейлериоза у крупного рогатого скота,содержащая лимфоидные клетки крупного рогатого скота,инфицированные шизонтами аттенуированного штамма. Эту вакцину вводят в виде дозы, содержащей 0,13 миллиона живых инфицированных клеток. Эту вакцину готовили путем выращивания . ,выделенного из клещей, в лимфоидных клетках крупного рогатого скота,используя питательную среду в течение 20100 дней, предпочтительно осуществляя более 612 пассажей при 37,5-38,5 С. Затем шизонты собирали и замораживали в присутствии подходящего криопротектора, предпочтительно глицерина, при температуре ниже -60 С. Недостатком вышеуказанной вакцины является то, что она содержит только от 0,1 до 3 миллионов клеток по сравнению с вакциной по настоящему изобретению, в которой содержится 5 миллионов клеток. Другим отличием от вышеуказанной вакцины является то,что используемым криопротектором является глицерин при -60 С,тогда как криопротектором, используемым в настоящем изобретении,является диметилсульфоксид и материал замораживают в жидком азоте при -179 С. В патенте А 25252 культуры выращивались методом роллерного культивирования 5-6 недель,что отнимает много времени. Одним из главных достоинств предлагаемой вакцины является краткосрочность процесса приготовления вакцин, то есть в течении 72 часов. В патенте ЕР 2228 В 1, 29.02.1984 г. описан терапевтический препарат для лечения клинических случаев тейлериоза у крупного рогатого скота и овец, где препарат содержит 2-циклоалкил-3 гидрокси-1,4-нафтохинон. Недостаток состоит в том, что он представляет собой лекарственное средство, предназначенное для лечебных целей, а не 30761 вакцину для профилактики и контроля за заболеванием. Ограничением вышеуказанных препаратов,следовательно, является то, что они подходят только для клинических случаев тейлериоза у крупного рогатого скота и овец и не имеют профилактического применения. Объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации крупного рогатого скота, а также телят данной местности против тейлериоза жвачных животных, вызываемого. Дополнительным объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации крупного рогатого скота тейлериоза жвачных животных,которая является безопасной для всех пород и для всех возрастов и стадий развития крупного рогатого скота, экономически выгодной, поскольку основана на промышленной технологии производства вакцины. Штаммы. При проведении исследований был использован южно-казахстанского штамма. Производственный штамм СУ-1 представляет собой стабилят размельченных инвазированных тейлериями клещей в криозащитной среде. Культура клеток и питательные среды. Для получения вакцины использовали лимфоидные клетки теленка, полученные трипсинизацией лимфоидной ткани, инвазированной . . согласно существующей инструкции. Культивируют при температуре 37 С в культуральной среде Лейбович, к которой перед использованием добавляют 15-20 сыворотки теленка от общего объма,раствор антибиотиков,содержащий бензилпенициллина натриевую соль 100 МЕ/мл(0,01), стрептомицина сульфат 100 мкг/мл (0,01),микостатина 10 МЕ/мл (0,001) и 200 глутамина на мл. Процессы. Культивирование первично трипсинизированных клеток теленка,инвазированных . , осуществляли в роллерных 5 - литровых флаконах в течение 2040 дней до образования суспензионной популяции клеток. Затем клетки культивировали глубинным периодическим суспензионным способом в ферментере. Технологическое оборудование. Для промышленной технологии получения вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота использовано оборудование автоклавируемый ферментер емкостью 6.7 л (Швецария) автоматизированная система управления технологическим процессом-,включающая микропроцессорный управляющий комплекс центрифуга на 6000 об/мин холодильник бытовой 4 С,холодильник емкостью 250 л на -40-60 С сосуд Дьюара СДС 50. Существующая промышленная технология изготовления вакцины против тейлериоза включает роллерное культивирование инвазированных тейлериями лимфоидных клеток теленка в бутылях емкостью 5 литров. Данный метод культивирования является технологически устаревшим, требует больших затрат труда, большого количества стеклянной посуды, не дает возможности поддерживать оптимальные значения технологических параметров культивирования. Для разработки современной промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза было предложено использовать метод глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка,инвазированных. Глубинное культивирование микроорганизмов происходит во всем объеме жидкой питательной среды,содержащей растворенный субстрат. Ферментер обеспечивает рост и развитие популяций микроорганизмов в объеме жидкой фазы, подвод питательных веществ к клеткам микроорганизмов,отвод от микробных клеток продуктов их обмена веществ (метаболизма), отвод из среды выделяемого клетками тепла. При глубинном культивировании скорость пролиферации и максимально достигаемая плотность клеток достаточно сильно зависят от сравнительно небольших измененийсреды. Хотя стандартные среды и стандартные условия культивирования рассчитаны на одинаковые значения , имеются данные, что для различных линий клеток оптимумыотличаются. Также на скорость пролиферации и плотность клеток в культуре влияет концентрация растворенного кислорода среды. Для культур животных клеток концентрация кислорода должна составлять приблизительно 25-40 от насыщения,поэтому к биореакторам для культивирования клеток животных кроме основных, перечисленных выше требований,предъявляются особые дополнительные, хотя они могут быть несколько снижены благодаря низким скоростям роста клеток животных и протекания в них метаболических процессов. Таким образом,теоретическое,аналитическое обоснование перевода процесса культивирования лимфоидных клеток теленка,инвазированных тейлериями, с роллеров в биореактор является также и практически обоснованным, что позволяет резко повысить производительность и снизить себестоимость технологического процесса производства вакцин. Предлагаемая промышленная технология получения вакцины против тейлериоза включает заражение тейлериями животного донора, отбор у него лимфоидной ткани с последующей ее трипсинизацией,выращивание культур лимфоидных клеток теленка в монослое до образования суспензионной популяции клеток,дальнейшее суспензионное культивирование клеток в биореакторе,их центрифугирование,криоконсервирование и расфасовку вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота. Для определения технологических параметров культивирования лимфоидных клеток теленка,3 30761 инвазированных . , проводились опыты по неуправляемому глубинному суспензионному культивированию лимфоидных клеток теленка в автоклавируемом ферментере емкостью 6.7 л(Швецария) при поддержании постоянной температуры культивирования 370,1 С и скорости перемешивания 40-60 об/мин. При управляемом глубинном суспензионном культивировании лимфоидных клеток теленкасреды снижалось с 7,2 в начале культивирования до 6,6 через 12 часов и оставалось на этой отметке до конца культивирования. Концентрация растворенного кислорода (О 3) снижалась с 21 кПа до 0 за 20 часов культивирования. Недостаток растворенного кислорода в культуральной жидкости при неуправляемом глубинном культивировании отразился на скорости роста клеток и их конечной концентрации. Так, за 48 часов культивирования при посадочной концентрации 200-250 тыс. клеток на мл индекс пролиферации составил 2-2,5 и конечная концентрация 400-500 тыс. клеток на мл. Концентрация растворенной углекислоты (СО 2) изменялась от 1 до 5 кПа, а окислительновосстановительный потенциал (еН) - от 30 до 10 мв. Данные опыты дали возможность определить технологические параметры культивирования лимфоидных клеток теленка в биореакторе и поддерживать их оптимальные значения в дальнейших опытах по управляемому культивированию. Оптимальным значениемпри культивировании лимфоидных клеток теленка,инвазированных тейлериями, является 7,2. В дальнейших опытах по управляемому культивированию лимфоидных клеток теленка поддержание оптимальных значений параметров культивированияи О 3 осуществлялось как поверхностной аэрацией биореактора смесью воздуха и СО 2, так и барботажем питательной среды этой же смесью. Так как растворенный кислород играет ключевую роль в процессе клеточного дыхания,необходимо рассчитать оптимальную концентрацию О 3 на всех фазах роста клеток. Фаза задержки клеточного роста длилась 89 часов и характеризовалась падением О 3 с 21 кПа до 12 кПа. В логарифмической фазе роста при интенсивном клеточном дыхании удавалось поддерживать О 3 не ниже 10 кПа барботажем питательной среды. Снижение О 3 ниже 10 кПа вело к снижению скорости клеточного роста. По истечении логарифмической фазы роста в течение нескольких часов наступала фаза отмирания,характеризовавшаяся гибелью всех клеток популяции. Концентрация растворенной углекислоты (рСО 2) зависела от значений , О 3, и процента СО 2 в газовой смеси при аэрации и изменялась от 4 до 1 кПа. Значениеизменялось от 50 до 35 мв в процессе культивирования. Сравнительный анализ существующей и разработанной технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза показал, что по разработанной технологии, благодаря оптимизации основных 4 параметров культивирования,устранению лимитирования роста клеток по растворенному кислороду и снижению влияния гидродинамических воздействий на рост клеток, за 72 часа культивирования, при объеме питательной среды 12 литров, удалось получить биомассу 16 млрд. клеток,что соответствует 120 тыс. доз при иммунизирующей дозе 0,1 млн. клеток. Для достижения аналогичного результата при роллерном культивировании потребовалось бы более 60 пятилитровых флаконов и время культивирования 4 недели. Обобщая результаты исследований можно заключить,что разработанная технология промышленного производства вакцины против тейлериоза обеспечивает снижение трудоемкости и себестоимости производства вакцины, повышает гарантию надежности технологического процесса и его экологическую безопасность. Готовую вакцину контролируют на стерильность, безвредность, реактогенность и иммуногенность, тщательно перемешивают и разливают в стерильные флаконы или ампулы. Вакцина сохраняет активность со дня изготовления при температуре хранения плюс 24 С - до двух месяцев. Полученную вакцину вводят внутримышечно, в дозе 1 мл на голову животных. Иммунизируют телят с 3-х месячного возраста до сезона нападения клещей на животных. Иммунитет у привитых животных образуются не позже 21-25 дня после вакцинации. Продолжительность иммунитета пожизненно. Безвредность вакцины проверяют на 6 морских свинках массой по 300-400 г путем введения внутримышечно в области бедра с внутренней стороны по 1 мл вакцины, разведенной раствором Хенкса в соотношении 110. Наблюдение за животным ведут в течение 10 суток. Вакцина оценивается как безвредная, если в течение срока наблюдения все морские свинки остаются клинически здоровыми и на месте инъекции отсутствуют воспалительные явления. Реактогенность вакцины проверяют на 6 телятах в возрасте 9-18 месяцев не ниже средней упитанности, из благополучных по тейлериозу хозяйств. Вакцину в объеме 1 мл инъецируют телятам внутримышечно. Животных наблюдают в течение 30-35 суток с ежедневной термометрией. Спустя 14-22 дня после введения вакцины отбирают образцы периферической крови телят и микроскопируют мазки с интервалом 3-5 суток до конца наблюдения. Вакцина не должна вызывать заболевание и гибель привитых животных. Допускается у привитых животных на 12-20 дни после иммунизации проявление слабой реакции в виде 15-дневного повышения температуры тела на 0,5-2 С и увеличение регионарных лимфатических узлов при удовлетворительном общем состоянии. В мазках крови привитых животных пораженность эритроцитов тейлериями не должно превышать 1. 30761 Иммуногенность вакцины определяется заражением через 30-35 дней после вакцинации шести (опытных) и двух невакцинированных телят(контрольных) вирулентным штаммом возбудителя тейлериоза путем подсадки в область груди и паха по 20-25 экземпляров инвазированных клещей или введения стабилята (приготовленного из указанного количества клещей) животным подкожно в область средней трети шеи. Наблюдения за телятами ведут 25-30 дней с ежедневным измерением температуры тела и микроскопированием мазков крови от телят с периодичностью один раз в 3-5 дней за весь период испытания. Вакцина считается иммуногенной,если иммунизированные животные не заболели тейлериозом, а контрольные телята должны заболеть на 10-15 день после заражения и погибнуть или переболеть с клиническими признаками тейлериоза (повышение температуры тела на 1,52,5 С в течение 9-16 дней при пораженности эритроцитов тейлериями равной 8-35 и более). Пример 1. Процесс осуществляют по выше описанной методике, но после получения исходного материала для культивирования пассирование культуры проводят три раза в неделю при следующем расчете к 2-3 мл старой культуры добавляют 7-8 мл свежей среды для роста, сохраняя общий объем до 10 мл. При этом состав компонентов среды изменяют в следующем соотношении, мас. сыворотка крови новорожденных телят 15-200,01-0,012 стрептомицина сульфат 0,01-0,012 микостатин 0,001-0,0012 200 М -глутамина 0,001-0,0012 антиген штамма 4,5-5,5106 клеток в 1 мл желатин 1-1,05 среда Лейбович остальное. Пример 2. В эксперименте использованы 82 телята 3-5 месячного возраста, содержащиеся в одних пастбищных условиях Меркинского района Джамбульской области. Ежегодная зараженность молодняка крупного рогатого скота тейлериозом в данном регионе составляет до 85, а взрослый скот на 85-95 является тейлерияносителем. Исследуемые животные разделены на опытные(41 голов) и контрольные группы (41 голов). За месяц до начало сезона заболеваемости тейлериозом животных опытной группы иммунизировали выше изложенной вакциной против тейлериоза. Телята контрольной группы не вакцинировались. Наблюдения за телятами вели в течение 8 месяцев. Результаты исследований показали, что среди животных опытной группы заболевание тейлериозом не регистрировалось (эффективность 100), а среди животных контрольной группы заболели 33 телят (зараженность 80,4). Таким образом, предлагаемая вакцина является безвредной - не вызывает осложнений, гибели вакцинированных животных и проявляет высокую профилактическую эффективность против тейлериоза крупного рогатого скота. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота, содержащая сыворотку крови новорожденных телят,, стрептомицина сульфат,микостатин, антиген штамма ееа ,среду Лейбович и желатин, отличающаяся тем, что дополнительно содержит 200 М-глутамина при следующем соотношении компонентов, мас. сыворотка крови новорожденных телят 15-200,01-0,012 стрептомицина сульфат 0,01-0,012 микостатин 0,001-0,0012 200 М -глутамина 0,001-0,0012 антиген штамма 4,5-5,5106 клеток в 1 мл желатин 1-1,05 среда Лейбович остальное.