Штамм бактерии vibrio cholerae o1 eltor inaba b-179, используемый для диагностики холеры и изготовления тест-системы

(51) 12 1/20 (2006.01) 61 39/02 (2006.01) 61 31/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ изготовлении тест-системы для микробиологической,генетической и серологической диагностики холеры. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в изыскании штамма холеры, используемый для проверки достоверности результатов диагностики холеры и изготовления тест-системы. Штамм бактерииВ-179 депонирован в Республиканской коллекции и депозитарии особо опасных микроорганизмов с музеем живых культур Республиканского государственного казенного предприятия Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева,используемый для диагностики холеры и изготовления тест-системы.(72) Мусагалиева Райхан Сафаровна Сагиев Заурбек Акимханович Жунусова Гульнур Сагиндыковна Исмаилова Акерке Оразалиевна Сайлаубеклы Ртбек Атовулаева Лилия Мадарисовна Насырова Гулнар Карагойшевна(73) Республиканское государственное казнное предприятие Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. Масгута Айкимбаева Агентства Республики Казахстан по защите прав потребителей(54) ШТАММ БАКТЕРИИ 1-179, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ И ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ(57) Изобретение относится к области медицинской микробиологии, может быть использовано при Изобретение относится к области медицинской микробиологии, может быть использовано при изготовлении тест-системы для микробиологической,генетической и серологической диагностики холеры. Известен штамм, используемый для получения холерных тест-систем и диагностики холеры А.с. СССР 1558987, кл. С 12 1/02,С 12 163, 1990. Недостатком штаммадля изготовления тест-систем и для диагностики холеры, является его относительно невысокая чувствительность и гемолитическая активность. Задачей изобретения является получение высокочувствительного штамма холеры с типичными культурально-морфологическими,биохимическими, серологическими свойствами для диагностики холеры при изучении фенотипических и генотипических свойств возбудителя. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в изыскании штамма холеры, используемый для проверки достоверности результатов диагностики холеры и изготовления тест-системы. Штамм бактерии 1179 депонирован в Республиканской коллекции и депозитарий особо опасных микроорганизмов с музеем живых культур Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева, используемый для диагностики холеры и изготовления тест-системы. Идентификацию штамма бактерии 1-179 проводят по морфологическим,культуральным, биохимическим и генетическим признакам. Происхождение штамма бактерии. Штамм бактерии выделен в Ордабасинском районе, ЮжноКазахстанской области 30 июля 2001 году от трупа умершего от холеры. Способ выделения - агар Хоттингера, щелочной агар, бульон Хоттингера и отбор колоний в -форме. Идентифицирован согласно определителю бактерии/, 2005., . 226.,, , 2008, . 120 Сравнен с типовыми коллекционными штаммами 1-145 (референтный),1878-М (референтный). Назначение штамма бактерии. Штамм типовой,используемый для приготовления тест-системы и для получения достоверности результатов диагностики холеры. Штамма 1-179 обладает генами(токсин холероген),(токсинкоррегулируемый пилей адгезивности). Состав среды и условия для культивирования агар Хоттингера состоящий из 2,3 агар-агар, 0,57 г/л двузамещенного безводного натрия. Т 37 С, - 7,2-7,6. Морфолого культуральные свойства. Возбудитель холеры - короткие, слегка изогнутые,подвижные грамотрицательные палочки, в мазках палочки располагаются отдельно и имеют полярно расположенный жгутик. Возбудитель холеры растет на агаре Хоттингера при температуре 37 С,- 7,2-7,6. Через 24 часа культивирования в термостате накопление бактериальной массы составляло более 2000 миллиардов микробных клеток в 1,0 см 3. При повторной проверке выбранного штаммаО 1-179, через 6 месяцев после хранения на агаре Хоттингера под вазелиновым маслом, была установлена его стабильность в быстроте роста и его свойств, что указывало на целесообразность его использования для получения достоверности результатов диагностики холеры и изготовления тест-системы. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганогетеротрофы. Типы катабализма факультативный анаэроб. Симбиотрофные отношения симбиотическое отношение с планктоном в водной среде. Источники углерода глюкоза. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты оксидаза, сахароза,манноза, арабиноза, декарбоксилазная активность к лизину и орнитину, ферментирует глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, не образует индол, ферментирует желатин и крахмал, не лизирует эритроциты барана,образует ацетилметилкарбинол. Антигенная структура. Штамм 1-179 агглютинируется с сыворотками О и Инаба до титра (О - 11600, Инаба 1400) образуя мелкие хлопья агглютината. Маркерные признаки. Штамм обладает декарбоксилазной активностью и протеолитическим свойством, гемолизнегативный, лизируется с диагностическими бактериофагами, имеет генов вирулентности , . Серологические свойства. РПГА с холерным антительным диагностикумом - положительная(титр - 110240), РТПГА (титр - 11280). Патогенные свойства. При определении вирулентности в реакции Грейга было установлено,что 1-179 имеет высокую вирулентность, так как не обладает гемолитической активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются при многократных пассажах через организм лабораторных животных и при пересевах на питательных средах (агар Хоттингера,сахара) при температуре 37 С,- 7,2-7,6. Способ, условия и состав сред для размножения штамма агар Хоттингера состоящий из 2,3 агар агар, 0,57 г/л двузамещенного безводного натрия. Молекулярно-биологические характеристики штамма 1-179. Молекулярно-биологические характеристики штаммаО 1-179,выражаются в нуклеотидных последовательностях,электрофореграмме и дендрограмме. Пример 1. Для определения токсигенности штаммов холерного вибриона, выделенных от людей и из объектов окружающей среды необходимы контрольные штаммы холерного вибриона, выделенные в Республике Казахстан(РК),для проведения дифференциальной диагностики холерного вибриона от других кишечных патогенов и для диагностики холеры, а также для конструирования тест-систем. Для выбора контрольного штамма были проведены генетические, микробиологические и биохимические исследования для изучения штаммов .1 и .О 1,выделенных от людей и окружающей среды в ЮКО,Кызылординской, Мангыстауской, ЗКО в 1997,2000, 2001, 2002, 2004, 2005, 2008, 2011 гг. Штаммы изучены микробиологическими, биохимическими и молекулярно-генетическими методами исследования. Для генетических исследований были использованы праймеры для детекции генов , ,. Исследования проводились с помощью классического ПЦР. Использованы тест-системы производства АмплиСенс . , ООО Лаборатории Изоген(Россия),праймеры,разработанные специалистами референслаборатории КНЦКЗИ. Целью данного исследования было проведения рутинных лабораторных исследования для отбора токсигенного штамма,который будет использоваться как контрольный штамм, на основе полученных фенотипических исследований. Для определения фенотипических свойств штаммов холерного вибриона были отобраны 50 штаммов холерного вибриона, выделенные на территории РК от людей и из объектов окружающей среды. Данные штаммы были исследованы классическими лабораторными тестами. Проведенные тесты позволили выделить токсигенные и нетоксигенные штаммы холерного вибриона. Кроме того, штаммы были разделены на два серологических групп - .О 1 и .О 1. Лабораторные тесты показали, что из 50 штаммов холерного вибриона 45 штаммов принадлежит к виду .1 и 5 к .1 (таблица 1). Из таблицы 1 видно, что из 50 изученных штаммов 40 штаммов .О 1 были токсигенными и 5 штаммов нетоксигенными. Из токсигенных штаммов 35 штаммов принадлежали к.1 были нетоксигенными. Таким образом, в качестве контрольного штамма для проведения дифференциальной диагностики холерного вибриона от других кишечных патогенов,для диагностики холеры и для конструирования тест-систем на основе фенотипических свойств был выбран .О 114. Штамм токсигенный, гемолизотрицательный выделен от трупа 30.07.2001 г. в Ордабасинском районе ЮжноКазахстанской области, РК. Для определения наличия генов токсигенностии ,принадлежность к .О 1- определение гена,необходимо провести полимеразную цепную реакцию. Пример 2. Основным критерием эпидемически опасных штаммов .1 считалось присутствие в их геноме структурных генов(или ), кодирующих биосинтез холерного токсина, локализованных в геноме нитевидного фага ф. геныиспользуются в качестве генетического маркера эпидемически опасных штаммов ., входят в состав умеренного нитевидного фага схф,который может инфицировать нетоксигенные штаммы. Однако геныне могут использоваться в качестве единственной генетической метки эпидемически опасных штаммов, так как они не уникальны не только для возбудителя холеры, но и для вида .. Для получения более полной и объективной информации об эпидемической значимости вибрионов в качестве генных маркеров вирулентности,кроме гена,были использованы геныи . Продукт генаосновная субъединица токсин-корегулируемых пилей адгезии, которые обеспечивают колонизацию вибрионами тонкого кишечника человека, без чего развитие инфекции невозможно. Генобуславливает экспрессию генови . ПЦРтестирование основных генов вирулентности (, и ) среди штаммов, выделенных из различных регионов, будет служить основой для определения тактики и необходимого объема противохолерных мероприятий. Биосинтез О 1 антигена определяет кластер генов, обозначенных как . Для изучения и для выбора контрольного штамма были проведены генетические исследования штаммов .О 1 и .О 1, выделенных от людей и окружающей среды в ЮКО, Кызылординской, Мангыстауской, ЗКО в 1997, 2000, 2001, 2002, 2004, 2005, 2008, 2011 гг. Штаммы изучены молекулярно-генетическими методами исследования. Для генетических исследований были использованы праймеры для детекции генов , , , . Исследования проводились с помощью классического ПЦР. Использованы тест-системы производства АмплиСенс . , ООО Лаборатории Изоген (Россия), праймеры, разработанные специалистами референс-лаборатории КНЦКЗИ. Исследовано 40 штаммов . 1,выделенных от людей во время вспышки и из объектов окружающей среды в ЮКО,Кызылординской, Мангыстауской, Атырауской областях. Микробиологические, биохимические и биологические тесты показали, что штаммы являются токсигенными и эпидемически опасными. 3 Для генетических исследований были использованы праймеры для детекции генов ,отвечающий за образование холерного токсина, ,отвечающий за гемолитическую активность иген, который определяет принадлежность к 1. Результаты исследования показаны в таблице 2. В таблице 2 представлены результаты исследования штаммов .О 1, выделенных от людей и объектов окружающей среды ЮКО. Исследованные токсигенные штаммы .О 1 имеют относительную генетическую однородность по изученным генетическим маркерам (фиг.1). Результаты генетических исследований, с использованием праймера для выявления гена ,кодирующего синтез пилей адгезии,(принадлежность к .О 1) показали, что изученные штаммов .О 1 обладают вышеуказанными генами. Наиболее выраженная экспрессия генов наблюдается у .О 1 14. Штамм токсигенный,гемолизотрицательный. Таким образом, генетические исследования токсигенных штаммов показали, что .О 114 имеет все гены вирулентости ,кодирующего синтез пилей адгезии,(принадлежность к .О 1). По фенотипическим и генетическим свойствам штамм токсигенный и вирулентный. Штамм может быть использован для дифференциальной диагностики холерного вибриона от других кишечных патогенов и для диагностики холеры. Таблица 1 Основная фенотипическая характеристика штаммов холерного вибриона, выделенных в РК Количество штаммов- - гемолизотрицательный, отрицательные биохимические свойства- гемолизположительный, положительные биохимические свойства Таблица 2 Результаты исследования штаммов .О 1, выделенных от людей и объектов окружающей среды ЮКО Название Место, год штамма выделения 1 2 Источник 3 вода вода вода вода вода люди люди люди люди люди люди люди люди люди люди люди люди люди люди люди люди люди вода Место, год выделения 2 ЮКО ЮКО ЮКО ЮКО ЮКО ЮКО ЮКО Мангыстауская область Атырауская область Атырауская область, 2002 ЮКО ЮКО ЮКО ЮКО Алматинская область Каракалпакстан,1997 Мангыстауская область, 2001 3 люди вода вода вода сточная вода вода люди люди люди люди канализационная вода люди люди- - отсутствие гена- наличие гена н/о - не определялось ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерииО 1,депонирован в Республиканской коллекции и депозитарии особо опасных микроорганизмов с музеем живых культур Республиканского государственного казенного предприятия Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева под номером В-179, используемый для диагностики холеры и изготовления тест-системы.