Способ получения ассоциированной инактивированной сорбированной вакцины против гриппа птиц и болезни ньюкасла

(51) 61 39/145 (2006.01) 61 39/12 (2006.01) 61 31/12 (2006.01) 12 7/00 (2006.01) 12 1/92 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ самого процесса вакцинации, сократит сроки формирования напряженного иммунитета у привитой птицы сразу против двух особо опасных патогенов и снизит себестоимость противоэпизоотических мер, проводимых против гриппа птиц А и болезни Ньюкасла. Способ получения ассоциированной инактивированной сорбированной вакцины против гриппа и болезни Ньюкасла, включающий репродукцию подтипового вируса гриппа птиц в развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию химическим агентом и эмульгирование в качестве подтипа вируса гриппа птиц используют штамм-0001 ЛБП - 5/3 КазНИВИ вируса гриппа типа А и дополнительно штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла, которые репродуцируют в развивающихся куриных эмбрионах в течение 48 ч при температуре 37-38 С,затем инактивируют формальдегидом в концентрации 0,05 в течение 48 ч при температуре 37-38 С и сорбируют на гели гидрата окиси алюминия, взятой в концентрации 1,0-1,2 к общему объему вирусной массы и получают целевой продукт.(72) Кутумбетов Леспек Бекболатович Мырзахметова Балжан Шайзадаевна Даутпаева Зауреш Жумагановна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ СОРБИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА ПТИЦ И БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для одновременной специфической профилактики гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении ассоциированной вакцины, содержащей в своем составе иммунизирующие компоненты против гриппа А подтипа /53 и болезни Ньюкасла,применение которой резко снизит трудоемкость Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для одновременной специфической профилактики гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Известен способ получения ассоциированной вакцины против гриппа птиц, включающий репродукцию подтипового вирусов гриппа птиц в развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию химическим агентом эмульгирование Патент Российской Федерации 2358760, кл. А 61 39/135,12 7/00, 2009. Недостатком известного способа получения ассоциированной вакцины против гриппа птиц является то, что биопрепарат не содержит иммунизирующего компонента против болезни Ньюкасла и для создания протективности против гриппа птиц подтипа /53 и болезни Ньюкасла требуется использование двух разных вакцин и проведение двукратной прививки птицы с затратой дополнительного времени на вакцинацию и формирование иммунитета. Задачей предлагаемого изобретения является создание ассоциированной вакцины, которая способна обеспечить формирование напряженного иммунитета сразу против гриппа птиц подтипа/53 и болезни Ньюкасла с помощью одной прививки. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении ассоциированной вакцины, содержащей в своем составе иммунизирующие компоненты против гриппа птиц подтипа /53 и болезни Ньюкасла,применение которой резко снизит трудоемкость самого процесса вакцинации, сократит сроки формирования напряженного иммунитета у привитой птицы сразу против двух особо опасных патогенов и снизит себестоимость противоэпизоотических мер, проводимых против гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Способ получения ассоциированной инактивированной сорбированной вакцины против гриппа птиц и болезни Ньюкасла, включающий репродукцию подтипового вируса гриппа птиц в развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию химическим агентом и эмульгирование, в качестве подтипа вируса гриппа птиц используют штамм-0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц типа А и дополнительно штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла,которые репродуцируют в развивающихся куриных эмбрионах в течение 48 ч при температуре 37-38 С,затем,инактивируют формальдегидом в концентрации 0,05 в течение 48 ч при температуре 37-38 С и сорбируют на гели гидрата окиси алюминия, взятой в концентрации 1,0-1,2 к общему объему вирусной массы и получают целевой продукт. Способ осуществляется следующим образом. Для приготовления ассоциированной инактивированной сорбированной вакцины против гриппа птиц и болезни Ньюкасла используют штамм - 0001 ЛБП - 5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц типа А и штамм -0016 Алматы-03 2 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла. Штаммы депонированы и хранится в Лаборатории генофонда культур микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(ТОО КазНИВИ). Штамм -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц типа А Штамм -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа А патогенен по отношению к курам и перепелам и обладает высокой репродуктивной активностью в развивающихся куриных эмбрионах и культуре фибробластов эмбрионов этих видов птицы, которая способствует накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема экстра-эмбриональной и культуральной жидкостей. Высокие концентрации вирусов гриппа птиц в экстра - эмбриональной и культуральной жидкостях обуславливают возможность получения из них инактивированного вакцинного препарата с высокими иммунобиологическими параметрами. Состав среды и условия культивирования. Для получения развивающихся эмбрионов кур или перепелов оплодотворенные инкубационные яйца этих видов птицы, свободных от патогенной микрофлоры инкубируют в специальных инкубаторах поддерживающих в камере инкубации температуру в пределах 37-38 С, влажность - не ниже 60 и обеспечивающих принудительный 4 кратный воздухообмен за час и автоматическое переворачивание яиц с эмбрионами периодичностью 2 раза за час в течение 10-12 суток. За период инкубации ежедневно яйца овоскопируют и контролируют развитие в них эмбрионов. С 10-х суток полученные эмбрионы используют для репродукции и вирусов гриппа птиц. Для получения монослойной культуры клеток фибробластов эмбрионы кур 10-12 суточного или перепелов 6-7-суточного возраста трипсинизируют с помощью 0,25 раствора трипсина и в концентрациях 200-400 тыс.кл/мл высевают и выращивают в матрасах или круговых сосудах с питательной средой, содержащей 90 среды ИГЛА и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, а через 24-48 ч, после образования полного монослоя в стенках сосудов, их используют для репродукции вирусов с применением той же питательной среды, но с 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культивирование культуры клеток и вирусов в ней осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус гриппа птиц типа А относится к семейству ,роду(А, В), вирионы плеоморфной или округлой формы, диаметром 80-120 нм, состоят из фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии диаметром 9-15 нм или липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной 10-13,5 нм. Штамм -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц подтипа возбудителя гриппа типа А из родасемейства . Культуральные свойства. Штамм -0001 ЛБП 5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц репродуцируется и накапливается в развивающихся куриных и перепелиных эмбрионах и культуре фибробластов этих эмбрионов в титре 107,25 ЭИД/ТЦД 50/см 3 и выше(эмбриональные инфекционные дозы/титр цитопатических доз,вызывающие эмбриональные/клеточные поражения у 50 инфицированных эмбрионов/культуры клеток). В указанном титре штамм вируса накапливается после двукратного последовательного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах или культуре фибробластов при использовании множественности заражения вирусом равной 0,1-0,0001 ЭИД 50/эмб или ТДЦ 50/кл. В развивающихся эмбрионах кур/перепелов пик накопления штамма вируса наступает через 48 ч после инфицирования возбудителем. Цитопатогенное действие штамма вируса в монослой зараженных фибробластов проявляется через 24 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади в период между 48 ч и 96 ч. Антигенные свойства. Штамм -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц при инокуляции в инактивированном формальдегидом виде в организме кур,перепелов,кроликов,коз стимулирует образование вируснейтрализующих антител (3-5 2) и антигемагглютининов (5-7 2). Патогенные свойства. Штамм -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц патогенен. Штамм-0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц вызывает развитие болезни с острым течением характеризующейся 80 и выше заболеваемостью и летальностью у инфицированных кур и перепелов. Иммуногенные свойства. Штамм -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц репродуцированные в развивающихся куриных эмбрионах после инактивации формальдегидом и сорбции гелью гидроокиси алюминия в дозе 0,5 см 3 при подкожном введении стимулирует формирование напряженного иммунитета против гриппа птиц в организме привитых кур, который формируется на 14 сутки и продолжается в течение не менее 6 месяцев. Привитая птица полностью не восприимчива к гомологичным вирулентным вирусам. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц при культивировании в развивающихся куриных эмбрионах сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц в экстраэмбриональной жидкости сохраняют свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 18-20 С - 3 месяцев (срок наблюдения), при минус 40 С и ниже - не менее 12 месяцев (срок наблюдения). Образцы вирусных штаммов, лиофилизированные в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 3,сахарозу 4 и желатин 1, сохраняют биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев. Штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла Штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла патогенен по отношению к курам и обладает также как и штамм вируса грипп А активной репродуктивностью в развивающихся куриных эмбрионах и культуре фибробластов этих эмбрионов,способствующая накоплению возбудителя в повышенных титрах. Высокие концентрации вирусов гриппа и болезни Ньюкасла в экстра-эмбриональной и культуральной жидкостях обуславливают возможность получения из них инактивированного вакцинного препарата с высокими иммунобиологическими параметрами. Состав среды и условия культивирования Для получения развивающихся эмбрионов кур или перепелов оплодотворенные инкубационные яйца этих видов птицы, свободных от патогенной микрофлоры инкубируют в специальных инкубаторах поддерживающих в камере инкубации температуру в пределах 37-38 С, влажность - не ниже 60 и обеспечивающих принудительный 4 кратный воздухообмен за час и автоматическое переворачивание яиц с эмбрионами периодичностью 2 раза за час в течение 10-12 суток. За период инкубации ежедневно яйца овоскопируют и контролируют развитие в них эмбрионов. С 10-х суток полученные эмбрионы используют для репродукции и болезни Ньюкасла. Для получения монослойной культуры клеток фибробластов эмбрионы кур 10-12 суточного или перепелов 6-7-суточного возраста трипсинизируют с помощью 0,25 раствора трипсина и в концентрациях 200-400 тыс.кл/мл высевают и выращивают в матрасах или круговых сосудах с питательной средой, содержащей 90 среды ИГЛА и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, а через 24-48 ч, после образования полного монослоя в стенках сосудов, их используют для репродукции вирусов с применением той же питательной среды, но с 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культивирование культуры клеток и вирусов в ней осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус болезни Ньюкасла относится к семейству ,подсемейству , роду ,вирионы в виде частиц плеоморфной, чаще округлой формы, диаметром 150-300 нм, состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной 8-12 нм. Штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя Ньюкаслской болезни из родаподсемейства Культуральные свойства. Штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла репродуцируется и накапливается в развивающихся куриных эмбрионах и культуре фибробластов этих эмбрионов в титре 109,25 ЭИД/ТДД 50/см 3 и выше(эмбриональные инфекционные дозы/титр цитопатических доз,вызывающие эмбриональные/клеточные поражения у 50 инфицированных эмбрионов/культуры клеток). В указанном титре штамм вируса накапливается после однократного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах или культуре фибробластов при использовании множественности заражения равной 0,01-0,00001 ЭИД 50/эмб или ТЦД 50/кл. В развивающихся эмбрионах кур пик накопления штамма вируса наступает через 48 ч после инфицирования возбудителем. В монослое культуры фибробластов цитопатогенное действие штамма вируса проявляется через 24 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади в период между 48 ч и 96 ч. Антигенные свойства. Штамм -0016 Алматы 03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла при инокуляции в инактивированном формальдегидом виде в организме кур, перепелов, кроликов, коз стимулирует образование вируснейтрализующих антител (3-5 2) и антигемагглютининов (5-7 2). Патогенные свойства. Штамм-0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла патогенны. Штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла вызывает остропротекающую тяжелую форму болезни со 100 заболеваемостью и летальностью среди кур. Иммуногенные свойства. Штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла,репродуцированные в развивающихся куриных эмбрионах после инактивации формальдегидом и сорбции гелью гидроокиси алюминия в дозе 0,5 см 3 при подкожном введении стимулирует формирование напряженного иммунитета против болезни Ньюкасла в организме привитых кур,который формируется на 14 сутки и продолжается в течение не менее 6 месяцев. Привитая птица полностью не восприимчива к гомологичным вирулентным вирусам. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла при культивировании в развивающихся куриных эмбрионах сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм -0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла в экстра эмбриональной жидкости сохраняют свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 18-20 С - 3 месяцев (срок наблюдения), при минус 40 С и ниже - не менее 12 месяцев (срок наблюдения). Образцы вирусных штаммов, лиофилизированные в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 3,сахарозу 4 и желатин 1, сохраняют биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев. Пример 1. Для получения ассоциированной инактивированной сорбированной вакцины против гриппа птиц и болезни Ньюкасла из эмбрионального вируса готовят развивающиеся куриные эмбрионы 10-12-суточного возраста путем инкубации инкубационных (оплодотворенных) яиц кур в специальных инкубаторах, поддерживающих в камере температуру в пределах 37-38 С, влажности воздуха не ниже 60 и обеспечивающих периодический воздухообмен и переворачивание яиц. Развитие и состояние эмбрионов контролируют овоскопированием и в возрасте 10-12 суток подвергают их инфицированию штаммами вируса болезни Ньюкасла по отдельности в дозе 0,01-0,001 ЭИД 50 путем инокуляции в аллантоисную полость. Инфицированные вирусами эмбрионы продолжают инкубировать при тех же условиях еще в течение 8 ч. По истечению указанного времени все эмбрионы охлаждают при температуре 41 С в течение 18-24 ч, вскрывают их и собирают асептически экстра-эмбриональную жидкость(аллантоисная) в качестве вирусной биологической массы. Собранную в единую емкость вируссодержащую экстра-эмбриональную жидкость замораживают при температуре минус 40 С,исследуют на наличие антигемагглютининов, титр вируса и контаминацию посторонней микрофлорой. Стерильную биологическую массу с титром гемагглютининов не ниже 7,0 2 подвергают инактивирующей обработке формальдегидом в концентрации 0,01 к общему объему вирусной массы в течение 48 ч при температуре 371 С,сорбируют гелью гидроокиси алюминия путем добавления ее в инактивированную вирусную массу в соотношении 1100 и отстоя в течение 24 ч при температуре 41 С после умеренного встряхивания. Полученную таким образом белую массу с сероватым оттенком принимают за конечный продукт - вакцину против гриппа птиц и болезни Ньюкасла инактивированную сорбированную,который в последующем подвергают стандартизации по иммунобиологическим свойствам. Иммунобиологические свойства вакцины характеризуются следующими данными. Стерильность по отношению к посторонним контаминантам. Стерильность вакцины испытывают согласно требованиям ГОСТ 28085. В вакцине не должны присутствовать посторонние контаминанты бактериального, грибкового и вирусного характера. Безвредность. На безвредность вакцину проверяют на десяти цыплятах 30-45-суточного возраста путем внутримышечного введения ее в дозе по 1,5-2,5 см 3/гол, содержащей 3-5-кратно превышающий прививной объем препарата. У вакцинированных цыплят в течение 10 суток после прививки не должны отмечаться какие-либо патологии местного и общего характера. Реактогенность. Реактогенность вакцины проверяют на десяти цыплятах 30-45-суточного возраста путем внутримышечного введения ее в иммунизирующей дозе,которая составляет 0,5 см 3/гол. Препарат должен быть слабо реактогенным. Реакция организма на введенную вакцину может проявляться у отдельных особей птицы на 2-4 сутки после прививки в виде слабой местной,характеризующейся гиперемией и воспалительным отеком в месте введения препарата, которая исчезает в течение 2-3 суток без ветеринарного вмешательства. В большинстве случаев реакция организма на введение вакцины клинически не проявляется. Иммуногенность. Иммуногенность вакцины проверяют на тридцати цыплятах 30-45-суточного возраста путем внутримышечного введения ее в иммунизирующей дозе (0,5 см 3/гол). Для этого вакцину с помощью стерильного одноразового шприца или специального дозатора вводят 30 цыплятам внутримышечно, а затем через 21 сутки всех привитых и 30 аналогичных цыплят, не привитых вакциной (контрольные), инфицируют вирулентными вирусами гриппа птиц подтипа 53 и болезни Ньюкасла в дозе по 10 3,0-4,0 ЦЛД 50/гол путем внутримышечного введения. Для проведения контрольного заражения вакцинированных и контрольных цыплят разделяют на две группы. Цыплят первый группы, состоящих из 10 вакцинированных и 10 не вакцинированных,заражают вирулентным вирусом гриппа А подтипа 53, второй группы, состоящей из аналогичного количества вакцинированных и не вакцинированных,инфицируют вирулентным вирусом болезни Ньюкасла. Вакцина считается иммуногенной, если в течение 14 суток после контрольного заражения не менее чем 80 привитых цыплят каждой группы останутся здоровыми и живыми при заболевании и гибели не менее чем 80 не вакцинированных цыплят каждой группы. Допускается клиническое выздоровление заболевших контрольных цыплят при сохранении требуемого количества больных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения ассоциированной инактивированной сорбированной вакцины против гриппа птиц и болезни Ньюкасла, включающий репродукцию подтипового вируса гриппа птиц в развивающихся куриных эмбрионах, инактивацию химическим агентом и эмульгирование,отличающийся тем, что в качестве подтипа вируса гриппа птиц используют штамм -0001 ЛБП-5/3 КазНИВИ вируса гриппа птиц типа А и дополнительно штамм-0016 Алматы-03 КазНИВИ вируса болезни Ньюкасла, которые репродуцируют в развивающихся куриных эмбрионах в течение 48 ч при температуре 37-38 С,затем инактивируют формальдегидом в концентрации 0,05 в течение 48 ч при температуре 37-38 С и сорбируют на гели гидрата окиси алюминия, взятой в концентрации 1,0-1,2 к общему объему вирусной массы и получают целевой продукт.