Способ изготовления инактивированной трехвалентной вакцины против ящура

(51) 61 39/135 (2006.01) 12 7/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ позволяющих получать биомассу штаммов вакцинных вирусов с высоким титром. Способ получения инактивированной трехвалентной вакцины против ящура, включающий использование штаммов выделенные на территории Казахстана типа А, О, Азия-1, репродукцию биомассы этих штаммов в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 371 С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей,инактивацию,концентрирование полученной суспензии и соединение концентрированного вируса с масляным адъювантом, отличающийся тем,что для получения высокоактивного вирусного сырья в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 371 С используют штаммы АК-200012 Д-05-12 А-2003-12 типов А, О и Азия-1, очистку вирусной суспензии от балластных примесей методом сепарирования, инактивацию,концентрирование полученного вируса ящура и соединение концентрированного вируса с масляным адъювантом один из марок монтанида -70,-50 или -206 производства фирмы(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ТРЕХВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯЩУРА(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии в частности к способу изготовления вакцинных препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для профилактики ящура. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается использовании штаммов вирусов, обладающих высокой иммуногенной эффективностью, и применении технологий, 29717 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии в частности к способу изготовления вакцинных препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для профилактики ящура. Известен способ изготовления инактивированной трехвалентной вакцины против ящура, включающий репродукцию вируса ящура в организме новорожденных крольчат, забивание больных животных, измельчение, очистку от балластных белков, инактивирование аминоэтиленимином,фильтрование вирусной суспензии через стерилизующие фильтры и добавление гидрата окиси алюминия Салажов Е.П. Ветеринарные препараты, М. Колос, 1981, с.66-73. Недостатком способа изготовления вакцины против ящура является низкая производительность технологии получения биологической массы возбудителя ящура и присутствие посторонних балластных белков. Задачей изобретения является повышение иммунологической эффективности трехвалентной инактивированной вакцины против ящура. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается использовании штаммов вирусов, обладающих высокой иммуногенной эффективностью, и применении технологий,позволяющих получать биомассу штаммов вакцинных вирусов с высоким титром. Способ получения инактивированной трехвалентной вакцины против ящура, включающий использование штаммов выделенные на территории Казахстана типа-0265 АК-2000-12, типа О-0267 Д-05-12, типа Азия-1 -0266 А-200312, репродукцию биомассы этих штаммов в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 371 С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей,инактивацию,концентрирование полученной суспензии и соединение концентрированного вируса с масляным адъювантом. Изобретение осуществляется следующим образом. Штаммы вируса ящура типа- 0265 АК 2000-12,типа О -0267 Д-05-12, типа Азия-1-0266 А-2003-12, используемые для получения инактивированной трехвалентной вакцины против ящура депонированы в лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО КазНИВИ и обладают следующими свойствами. Штамм вируса ящура типа-0265 КазНИВИ АК-2000-12 Репродуктивные свойства. Штамм вируса ящура типа-0265 КазНИВИ АК-2000-12 репродуцируется и накапливается в перевиваемой линии клеток ВНК-21/13 в титре 109,50 ТЦД 50/см 3. В указанной перевиваемой культуре клеток штамм-0265 КазНИВИ А-2003-12 вируса ящура типа А активно размножается и начало цитопатического действия отмечается через 8-9 часов после инфицирования, поражая к 20-30 часам около 8090 монослоя клеток. Штамм вируса на уровне 5-7 пассажей в культуре клеток ВНК-21/13 характеризуется высокой репродуктивной активностью. Повышение инфекционной и комплементсвязывающей активности достигнуто в результате клонирования исходного культурального штамма,путем предельного разведения. Биологическая активность клонированных вариантов штамма перевиваемой линии клеток ВНК-21/13 достигает до 9,50 ТЦД 50/см 3. Антигенные свойства. Штамм вируса ящура типа-0265 КазНИВИ АК-2000-12 в организме зараженных животных (белые мыши, морские свинки, кролики, крупный рогатый скот) вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и прецепитирующих антител. Патогенные свойства. Штамм вируса ящура типа-0265 КазНИВИ АК-2000-12 у инфицированных мышат-сосунов и крольчат вызывает развитие типичных клинических признаков болезни ящура (парезы и параличи конечностей,мышц туловищ и шеи),заканчивающиеся гибелью животных в течение 2026 ч после заражения. В организме зараженных лабораторных животных вирус накапливается в титрах 108,5-109,3 ЛД 50/01 мл (летальная мышиная доза,вызывающих 50 гибель мышат- сосунов). Иммуногенные свойства. Штамм вируса ящура типа-0265 КазНИВИ АК-2000-12 репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13,инактивированный димером этиленимина и добавленный масляного адъюванта при подкожном введении крупному рогатому скоту в дозе 3 мл стимулирует образования напряженного противоящурного иммунитета. Все иммунизированные животные при контрольном заражении оставались клинически здоровыми в течение 10 суток после их инфицирования вирулентным вирусом ящура типа А. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма вируса ящура типа-0265 КазНИВИ АК-2000-12,при культивировании в культуре клеток ВНК-21/13 сохраняются в течение 12 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм вируса ящура типа-0265 КазНИВИ АК-2000-12 в виде культуральной суспензии не снижает биологическую активность при температуре 41 С в течение 40 сут, при минус 30 С-18 мес, а в виде фарша из тушек крольчат с консервантом(глицеринфизиологический раствор аа) при 7,5 в течение 6 месяцев при температуре 41 С,36 мес - при минус 40 С. Штамм вируса ящура типа Азия-1 -0266 КазНИВИ А-2003-12 Штамм -0266 вируса ящура типа Азия-1 получен путем клонирования исходного штамма методом предельного разведения с последующей репродукцией на перевиваемой линии клеток ВНК 21/13 и обозначен как штамм -0266 вируса ящура типа Азия -1 КазНИВИ А-2003-12. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Штамм -0266 вируса ящура типа Азия-1 КазНИВИ А-2003-12 обладает высокой репродуктивной активностью на культуре клеток ВНК-21/13,антигенной и иммуногенной активностью. Повышает эффективность профилактических препаратов и диагностики ящура животных. Штамм используют для изготовления вакцинных и диагностических биопрепаратов. Состав среды и условия культивирования Среда Игла-МЕМ, содержащий 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Морфологические признаки. Вирус ящура типа Азия-1 относится к мелким вирусам парнокопытных животных. Размер вириона 22-25 нм, имеет сферическую (икосаэдрический) форму, состоит из одноцепочечной линейной молекулы РНК,заключенную в белковую оболочку, состоящей главным образом из четырех структурных белков 1, 2, 3 4. Вирус содержит 31,5 РНК и 68,5 протеинов. Молекула белка состоит из 5 полипептидных цепей, который содержит 18 аминокислот. Штамм -0266 КазНИВИ А-2003-12 вируса ящура типа Азия-1 обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя ящура рода афтовирусов семейства пикорновирусов. Культуральные свойства. Штамм -0266 КазНИВИ А-2003-12 вируса ящура типа Азия-1 репродуцируется и накапливается в перевиваемой линии клеток ВНК-21/13 в титре 109,25 ТЦД 50/см 3. В указанной перевиваемой культуре клеток штамм-0266 КазНИВИ А-2003-12 вируса ящура типа Азия-1 активно размножается и начало цитопатического действия отмечается через 7-9 часов после инфицирования, поражая к 25-32 часам около 80-90 монослоя клеток. Штамм вируса на уровне 7-8 пассажей в культуре клеток ВНК-21/13 характеризуется высокой репродуктивной активностью. Повышение инфекционной и комплементсвязывающей активности достигнуто в результате клонирования исходного культурального штамма,путем предельного разведения. Биологическая активность клонированных вариантов штамма 9,25 ТЦД 50/см 3. Антигенные свойства. Штамм-0266 КазНИВИ А-2003-12 вируса ящура типа Азия-1 в организме зараженных животных (белые мыши,морские свинки, кролики, крупный рогатый скот) вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и прецепитирующих антител. Патогенные свойства. Штамм-0266 КазНИВИ А-2003-12 вируса ящура типа Азия-1 у инфицированных мышат-сосунов и крольчат вызывает развитие типичных клинических признаков болезни ящура (парезы и параличи конечностей,мышц туловищ и шеи),заканчивающиеся гибелью животных в течение 1824 ч после заражения. В организме зараженных лабораторных животных вирус накапливается в титрах 108,5-109,3 ЛД 50/0,1 мл (летальная мышиная доза,вызывающих 50 гибель мышат- сосунов). Иммуногенные свойства. Штамм -0266 КазНИВИ А-2003-12 вируса ящура типа Азия-1 репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13,инактивированный димером этиленимина и добавленный масляного адъюванта при подкожном введении крупному рогатому скоту в дозе 3 мл стимулирует образования напряженного противоящурного иммунитета. Все иммунизированные животные при контрольном заражении оставались клинически здоровыми в течение 7 суток после их инфицирования вирулентным вирусом ящура типа Азия-1. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма -0266 КазНИВИ А-2003-12 вируса ящура типа Азия-1,при культивировании в культуре клеток ВНК-21/13 сохраняются в течение 15 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм -0266 КазНИВИ А 2003-12 вируса ящура типа Азия-1 в виде культуральной суспензии не снижает биологическую активность при температуре 41 С в течение 40 сут, при минус 30 С-18 мес, а в виде фарша из тушек крольчат с консервантом (глицеринфизиологический раствор аа) при 7,5 в течение 6 месяцев при температуре 41 С, 36 мес - при минус 40 С. Штамм вируса ящура типа О -0267 КазНИВИ Д-05-12 Штамм вируса ящура типа О -0267 КазНИВИ Д-05-12 получен путем клонирования исходного штамма методом предельного разведения с последующей репродукцией на перевиваемой линии клеток ВНК-21/13 и обозначен как штамм вируса ящура типа О -0267 КазНИВИ Д-05-12. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Штамм вируса ящура типа О -0267 КазНИВИ Д-05-12 обладает высокой репродуктивной активностью на культуре клеток ВНК-21/13,антигенной и иммуногенной активностью. Повышает эффективность профилактических препаратов и диагностики ящура животных. Штамм используют для изготовления вакцинных и диагностических биопрепаратов. Состав среды и условия культивирования Среда Игла-МЕМ, содержащий 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Морфологические признаки. Вирус ящура типа О относится к мелким вирусам парнокопытных животных. Размер вириона 22-25 нм, имеет сферическую (икосаэдрический) форму, состоит из одноцепочечной линейной молекулы РНК,заключенную в белковую оболочку, состоящей главным образом из четырех структурных белков 1,2, 3, 4 Вирус содержит 31,5 РНК и 68,5 протеинов. Молекула белка состоит из 5 полипептидных цепей, который содержит 18 аминокислот. Штамм Д-05-12 вируса ящура типа О обладает морфологическими признаками, свойственными для 3 возбудителя ящура рода афтовирусов семейства пикорновирусов. Культуральные свойства. Штамм вируса ящура типа О-0267 КазНИВИ Д-05-12 репродуцируется и накапливается в перевиваемой линии клеток ВНК-21/13 в титре 109,00 ТЦД 50/см 3. В указанной перевиваемой культуре клеток штамм Д-05-12 вируса ящура типа О активно размножается и начало цитопатических изменений отмечается через 8-10 часов после инфицирования,поражая к 32-36 часам около 70-80 клеток монослоя. Штамм вируса на уровне 10-12 пассажей в культуре клеток ВНК-21/13 характеризуется высокой репродуктивной активностью. Повышение инфекционной и комплементсвязывающей активности достигнуто в результате клонирования исходного культурального штамма,путем предельного разведения. Биологическая активность клонированных вариантов штамма на культуре клеток ВНК-21/13 9,00 ТЦД 50/см 3. Антигенные свойства. Штамм вируса ящура типа О -0267 КазНИВИ Д-05-12 в организме зараженных животных (белые мыши, морские свинки, кролики, крупный рогатый скот) вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и прецепитирующих антител. Патогенные свойства. Штамм вируса ящура типа О -0267 КазНИВИ Д-05-12 у инфицированных мышат-сосунов и крольчат вызывает развитие клинических признаков ящура (парезы и параличи конечностей,мышц туловищ и шеи),заканчивающиеся гибелью животных в течение 2026 ч после заражения. В организме зараженных лабораторных животных вирус накапливается в титрах 108,0-109,00 ЛД 50/0,1 мл (летальная мышиная доза, вызывающих 50 гибель мышат-сосунов). Иммуногенные свойства. Штамм вируса ящура типа О-0267 КазНИВИ Д-05-12 репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13,инактивированный димером этиленимина и добавленный масляного адъюванта при подкожном введении крупному рогатому скоту в дозе 3 мл стимулирует образования напряженного иммунитета против возбудителя ящура. Все иммунизированные животные при контрольном заражении оставались клинически здоровыми в течение 12 суток после их инфицирования вирулентным вирусом ящура типа О. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма вируса ящура типа О -0267 КазНИВИ Д-05-12, при культивировании в культуре клеток ВНК-21/13 сохраняются в течение 17 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм вируса ящура типа О-0267 КазНИВИ Д-05-12 виде культуральной суспензии не снижает биологическую активность при температуре 41 С в течение 40 сут, при минус 30 С-20 мес, а в виде фарша из тушек крольчат с консервантом (глицеринфизиологический раствор аа) при 7,5 в течение 6 месяцев при температуре 41 С, 36 мес - при минус 40 С. Пример 1. Наработку вирусной массы типа А проводят с использованием штамма АК-2000-12, который репродуцируют в суспензии перевиваемой линии культур клеток ВНК-21/13 при температуре 37 С. Через каждые 3 часа после начало культивирования осуществляют забор проб вирусной суспензии,клетки окрашивают метиленовой синью для определения и подсчета живых клеток и клеток с цитопатическим эффектом. При поражении более 90 клеток суспензии забор проб прекращают, а процесс культивирования вируса продолжает в течении 3-4 часов. После окончания процесса культивирования в ферментер добавляют хлороформ до конечной концентрации 1,0, эмульгирование биологической массы проводят при постоянном перемешивании вирусной суспензии, после окончании которого суспензию подвергают сепарированию для удаления балластных белков. Инактивацию вируса проводят добавлением в суспензию бинарного этиленимина в конечной концентрации 0,03 и при температуре 27 С в течении 30 часов. После окончания срока инактивации в суспензию добавляют 50 тиосульфат натрия для нейтрализации остаточного инактиванта и 10 тиомерсал 0,002 мл для консервации. Содержание 146 компонентов в прививной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146 компонентов вируса ящура должна быть не менее 0,7 мкг/мл при изготовлении моновалентной вакцины. В полученную вирусную суспензию согласно инструкции по применению добавляют один из марок монтанида -70, -50 или-206 производства фирмы(Франция). Полученную вакцину расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность,безвредность и иммуногенную активность. Пример 2 Наработку вирусной массы типа О проводят с использованием штамма Д-05-12, который репродуцируют в суспензии перевиваемой линии культур клеток ВНК-21/13 при температуре 37 С. Через каждые 3 часа после начало культивирования осуществляют забор проб вирусной суспензии,клетки окрашивают метиленовой синью для определения и подсчета живых клеток и клеток с цитопатическим эффектом. При поражении более 90 клеток суспензии забор проб прекращают, а процесс культивирования вируса продолжает в течении 6-8 часов. После окончания процесса культивирования в ферментер добавляют хлороформ до конечной концентрации 1,0, эмульгирование биологической массы проводят при постоянном перемешивании вирусной суспензии, после окончании которого суспензию подвергают сепарированию для удаления балластных белков. Инактивацию вируса проводят добавлением в суспензию бинарного этиленимина в конечной концентрации 0,03 и при температуре 27 С в течении 30 часов. Содержание 146 компонента в прививной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146 компонента вируса ящура должна быть не менее 1,5 мкг/мл при изготовлении моновалентной вакцины. В полученную вирусную суспензию согласно инструкции по применению добавляют один из марок монтанида -70, -50 или-206 производства фирмы(Франция). Полученную вакцину расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность,безвредность и иммуногенную активность. Пример 3 Наработку вирусной массы типа Азия-1 проводят с использованием штамма А-2003-12, который репродуцируют в суспензии перевиваемой линии культур клеток ВНК-21/13 при температуре 37 С. Через каждые 3 часа после начало культивирования осуществляют забор проб вирусной суспензии,клетки окрашивают метиленовой синью для определения и подсчета живых клеток и клеток с цитопатическим эффектом. При поражении более 90 клеток суспензии забор проб прекращают, а процесс культивирования вируса продолжает в течении 7-8 часов. После окончания процесса культивирования в ферментер добавляют хлороформ до конечной концентрации 1,0, эмульгирование биологической массы проводят при постоянном перемешивании вирусной суспензии, после окончании которого суспензию подвергают сепарированию для удаления балластных белков. Инактивацию вируса проводят добавлением в суспензию бинарного этиленимина в конечной концентрации 0,03 при температуре 27 С в течении 30 часов. Содержание 146 компонента в прививной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146 компонента вируса ящура должна быть не менее 1,5 мкг/мл при изготовлении моновалентной вакцины. В полученную вирусную суспензию согласно инструкции по применению добавляют один из марок монтанида -70, -50 или-206 производства фирмы(Франция). Полученную вакцину расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность,безвредность и иммуногенную активность. Пример 4 Формирование поливалентной вакцины. При изготовлении трехвалентной вакцины после наработки биологической массы типов А, О и Азия-1 и проведении всех технологических операций аналогично примерам 1-3 их смешивают с расчетом в конечном прививном дозе вакцины должна быть- авирулентный и очищенный вирус типа А, не менее 2,0 мкг 146- компонента- авирулентный и очищенный вирус типа О, не менее 4,0 мкг 146- компонента- авирулентный и очищенный вирус типа Азия-1,не менее 3,0 мкг 146- компонента(Франция) - в соотношениях от 37 до 11 в зависимости от вида вакцинируемого животного- поддерживающая среда - до 2 мл. Инактивированная трехвалентная вакцина против ящура типов А, О и Азия-1 изготовленная согласно предлагаемого способа прошла успешное испытание по стерильности, авирулентности,безвредности и иммуногенной активности, что указывает на соответствие требованиям Международного Эпизоотического бюро (МЭБ),предъявляемым к профилактическим препаратам против ящура. Таким образом, заявляемый способ изготовления вакцины против ящура позволяет увеличить количество вирусного, основного иммуногенного компонента 146 в прививном дозе препарата,способ также обеспечивает безвредность,авирулентность и высокую иммуногенную активность вакцины. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления инактивированной трехвалентной вакцины против ящура, включающий репродукцию вируса ящура в организме новорожденных крольчат, измельчение, очистку от балластных белков,инактивирование аминоэтиленимином,фильтрование вирусной суспензии через стерилизующие фильтры и добавление гидрата окиси алюминия,отличающийся тем,что для получения высокоактивного вирусного сырья в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 371 С,используют штаммы-0265 типа А АК-2000-12,типа Азия-1 -0266 А-2003-12,типа О -0267 Д-05-12, затем проводят очистку вирусной суспензии от балластных примесей сепарированием, после чего проводят инактивацию при температуре 27 С,концентрирование полученной вирусной суспензии ящура и соединяют с масляным адъювантом -70, и получают целевой продукт.