Способ получения r- бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации

(51) 61 10/00 (2006.01) 61 39/10 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации,включающий изготовление -антигена из штамма бруцелл путем механического разрушения растиранием выпавших в осадок после центрифугирования микробных клеток и сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана оттитрованным-антигена используют штаммВ-0176,который предварительно подвергают замораживанию при температуре -20 С, после чего оттаиванию с последующим воздействием на бруцеллезную взвесь ультразвуковых волн частотой 22 кГц и мощностью 90 Вт/см 2 трехкратно в течение 15 минут, затем озвученную бактериальную взвесь подвергают центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 минут, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость используют в качестве целевого продукта.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Оспанов Ержан Калиолдинович Мырзалиев Ахан Жакангерович Тспанлы Оралан Мтхан Нрли(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ(57) Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к лабораторной диагностике бруцеллеза животных и может быть использовано в микробиологии и иммунологии. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении эффективного антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных. Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к лабораторной диагностике бруцеллеза животных и может быть использовано в микробиологии и иммунологии. Известен способ получения -бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации,включающий изготовление -антигена из штамма бруцелл путем механического разрушения растиранием выпавших в осадок после центрифугирования микробных клеток и сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана оттитрованным-антигеном,экспозицию с последующим отмыванием эритроцитов Патент Российской Федерации 2411041, кл. А 61 39/10,01 33/531, 2011 г Недостатком известного способа является не высокая чувствительность и специфичность препарата. Задачей изобретения является получение высокочувствительного,специфичного и стабильного-антигенного эритроцитарного диагностикума для экспресс диагностики больных бруцеллезом и инфекционным эпидидимитом животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении эффективного-антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления животных,зараженных диссоциированными формами бруцелл. Способ получения-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации,включающий изготовление -антигена из штамма бруцелл путем механического разрушения растиранием выпавших в осадок после центрифугирования микробных клеток и сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана оттитрованным- антигена используют штаммВ-0176,который предварительно подвергают замораживанию при температуре -20 С, после чего оттаиванию с последующим воздействием на бруцеллезную взвесь ультразвуковых волн частотой 22 кГц и мощностью 90 Вт/см 2 трехкратно в течение 15 минут, затем озвученную бактериальную взвесь подвергают центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 минут, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость используют в качестве целевого продукта. Изобретение осуществляют следующим образом. Для получения-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума используют штаммВ-0176, который хранится в рабочей коллекции Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ). Штамм характеризуется следующими признаками. Происхождение штамма бактерий. Штамм бактерий получен из ВИЭМ им. Гамалеи в 1989 году 2 и выделен из организма на питательной среде гидролизная среда, печоночно-сывороточный агар(ПСА), печеночно-амиднопептидный агар (ПАА). Идентифицирован по определителю бактерий,2005,, .370-386. Назначение штамма бактерий. Штамм эталонный для приготовления диагностических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид,тиамин-бромид,глюкоза,глицерин,эритрит, агар- агар, дрожжевой экстракт, -цистин. Т 37-38 С. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит агаре с добавками, То 36-37,5 С, в течение 48 часов в термостате с содержанием 10 СО 2. Овоиды, длиной 0,7-1,2 мкм, шириной 0,5 - 0,7 мкм, неподвижные, очертания концов округлые, по Граму не окрашиваются, окрашиваются по методу Козловского,не кислотоустойчивы,тип размножения деление, специализированные клетки не образуют. Размер колоний 0,2-3,0 мм, круглые, менее выпуклые,часть колонии не правильно контурированные, -форма, колоний плотные,гладкие. Рост в жидкой среде - вызывает помутнение МПБ в течение суток, в дальнейшем хлопчатый осадок и зона просветления над осадком. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразитизм, фагом Тб не лизируется. Источники углерода глюкоза, глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы цистин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, не образует сероводород и индол, не разжижает желатин, не свертывает молоко, не разлагает сахарозу, лактозу,глюкозу, манит, дульцит, сорбит, мочевину, не редуцирует нитраты и нитрит, не лизирует эритроциты, не образует ацетилметилкарбинол. Маркерные признаки штамма. Растет на средах с пенициллином, находится в стабильной - форме,обладает каталазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Эталонный штаммВ-0176 хранят в сухом виде в запаянных под вакуумом ампулах при температуре от 4 до 6 С. Пересев нативных культур проводят один раз в 3-4 месяца. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Пример 1. Приготовление сенситина из бруцелл для адсорбции на эритроциты барана. Антиген для сенсибилизации эритроцитов готовят путем предварительного замораживания при температуре -20 С, после чего оттаивают с последующим воздействием на бруцеллезную взвесь ультразвуковых волн частотой 22 кГц и мощностью 90 Вт/см 2 трехкратно в течение 15 минут, затем озвученную бактериальную взвесь подвергают центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 минут, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость декантируют и используют в качестве сенситина. Пример 2. Получение антигенного эритроцитарного диагностикума. Формалинизированные эритроциты обрабатывают танином, с этой целью берут равные объемы (11) раствора танина (120000) и 5 взвеси эритроцитов тщательно смешивают и выдерживают в водяной бане 15 минут при температуре 37-38 С. После этого обработанные танином эритроциты 3-4 кратно отмывают от танина физиологическим раствором ( 7,2) с помощью центрифугирования при 1000 об/минуту в течение 10 минут. Отмытые эритроциты собирают с центрифужных пробирок и доводят их до первоначального объема(5 взвесь) 5-ным раствором хлорида натрия и туда же вносят 0,25 - детергент вторичного алкилсульфата натрия с рН 6,2-6,4. Для определения минимальной сенсибилизирующей дозы -антигена (сенситина) проводят его сенсибилизацию возрастающими дозами, при температуре 45-50 С, в течение одного часа, при периодическом встряхивании каждые 5-8 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют формалин из расчета 1 см 3 на 200 см 3 смеси. Для этого в пробирки с 1 см 3 5-ной взвеси эритроцитов добавляют 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 до 4,0 см 3 -антигена, смесь перемешивают и выдерживают на водяной бане в течение одного часа при 45-50 С. Затем сенсибилизированные эритроциты отмывают от избытка -антигена в течение 30 минут трехкратно физиологическим раствором с добавлением к нему 1 нормальной инактивированной кроличьей или 2,5 лошадиной сыворотки крови. Физраствор для отмывания берут в десятикратном объеме. Затем в каждую пробирку с осадком отмытых сенсибилизированных эритроцитов вносят по 2 см 3 физиологического раствора со стабилизатором (свежая кроличья или лошадиная сыворотка крови). Полученные 2,5-ные взвеси эритроцитов, сенсибилизированные разными дозами -антигена (-сенситина), гомогенизируют встряхиванием пробирок и проверяют в РНГА на активность и специфичность. После приготовления для консервации применяют 0,3 формальдегид. Готовый препарат хранят в холодильнике при 4-6 С. Титром антигена считается предельное его разведение, которое обеспечивает агглютинацию эритроцитов положительной сывороткой в предельном ее разведении. Пример 3. Диагностикум эритроцитарный бруцеллезный антигенный проверяют на внешний вид, растворимость, гомогенность, влажность,стерильность,концентрацию эритроцитов,активность и специфичность. Внешний вид определяют визуально,просматривая флаконы в проходящем свете. Флаконы должны быть целыми, без трещин и иметь одинаковый объем содержимого. Одновременно флаконы проверяют на плотность укупорки и правильность этикирования. Для определения растворимости во флакон с сухой аморфной массой добавляют 11 см 3 0,9-ного раствора натрия хлорида, при этом должна образоваться равномерная взвесь коричневого цвета,без видимых скоплений эритроцитов, в течение одной минуты. Для определения гомогенности 5-ную взвесь диагностикума разводят в 10 раз 0,9-ным раствором натрия хлорида до получения 0,5-ной концентрации, затем каплю такой взвеси наносят на предметное стекло, покрывают стеклом и микроскопируют при малом увеличении микроскопа. Эритроциты должны располагаться изолированно, при этом могут встречаться и небольшие скопления, не более чем по 10 эритроцитов и не более 3 скоплений в 10 полях зрения. Влажность должна быть не выше 3. Диагностикум на стерильность не проверяют. Для определения концентрации эритроцитов диагностикум содержащий 5-ную взвесь, разводят и получают 2,5-ную взвесь, которую далее разводят 0,9-ным раствором натрия хлорида в 200 раз. Затем каплю взвеси помешают в камеру Горяева и подсчитывают с помощью микроскопа количество эритроцитов. Для получения удовлетворительного результата подсчитывают не менее 5 больших квадратов или 80 маленьких. Для каждой серии подсчет эритроцитов проводят 2 раза. Препарат отвечает требованиям, если он содержит в 1,0 см 3 2,5 -ной взвеси не более 550 000 эритроцитов. Определение специфичности и активности. Эритроцитарный антигенный диагностикум проверяют на активность и специфичность с заведомо известными позитивными, негативными сыворотками. Берут положительную,отрицательную сыворотки разводят их физиологическим раствором с добавлением в качестве стабилизатора сыворотки крови кролика 1 или лошади 2,5. Позитивную сыворотку разводят 125, 150,1100, 1200, 1400, 1800, 11600, 13200, 16400,112800 и 125600, а негативную сыворотку - 125,1100, 1200. Все разведения сыворотки крови инактивируют путем прогревания в водяной бане сыворотки крупного рогатого скота при 58 С - 59 С сыворотки овец при 60 С в течение 30 минут, после чего их переносят в лунки полистироловой пластины в объеме 500 мкл. Затем в первые лунки (контроль сыворотки 125) добавляют дозатором по 50 мкл контрольных несенсибилизированных бараньих эритроцитов, начиная со второй 125, вносят по 50 мкл сенсибилизированных эритроцитов (диагностикума). Эритроциты следует добавлять так,чтобы капли не стекали по стенке, а падали непосредственно в жидкость. Содержимое луночек 3 тщательно,но осторожно перемешивают встряхиванием пластины до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре. В связи с высокой чувствительностью РНГА не допускается разбрызгивания жидкости при титрации сывороток. Для контроля реакции ставят контроли с нормальной сывороткой кролика (1100) в двух лунках. В первую лунку к 500 мкл сыворотки добавляют 50 мкл 2,5 взвеси диагностикума, во вторую 50 мкл контрольных несенсибилизированных эритроцитов барана. Затем во все пробы сыворотки,участвующие в реакции в разведении 125 добавляют танизированные,но несенсибилизированные эритроциты. При обнаружении в сыворотках гетерогемагглютининов их следует адсорбировать 50 взвесью формалинизированных эритроцитов. Для этого к 1,0 см 3 сыворотки добавляют 0,1 см 3 взвеси формалинизированных эритроцитов,смесь встряхивают и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем сыворотку отстаивают и надосадочную жидкость отсасывают и получают целевой продукт. Учет реакции непрямой гемагглютинации проводят визуально в крестах-(4 креста) - 100-ная агглютинация эритроцитов, гладкий налет по всему дну лунки,возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде зонтика-(3 креста) - 75-ная агглютинация в виде хорошо выраженного зонтика меньшего диаметра,чем при оценке реакции на 4 креста. В центре лунки возможно образование малозаметного кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов-(два креста) - на дне лунки осевшие неагглютинированные эритроциты образуют ровное кольцо с зернистостью вокруг него (50-ная агглютинация)-(1 крест) - эритроциты оседают в виде компактной пуговки или колечка. За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла четкая агглютинация эритроцитов с оценкой 4 или 3 креста. Все сыворотки,давшие РИГА с оценкой в 2 или 1 крест, считают отрицательными. Реакция наступает через 2-3 часа. Учет реакции проводят через 3 часа. Результаты проверки активности и специфичности-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в РНГА представлены в таблице 1. Из приведенных данных в таблице 1 видно, что наименьшей дозой сенситина (антигена), необходимой для получения эритроцитарного диагностикума с высокой активностью и специфичностью, является 2,5 см 3 его на 1 см 3 5-ной взвеси стабилизированных и танизированных эритроцитов барана. Такую дозу антигена берут для изготовления диагностикума. В таблице 2 показаны результаты проверки активности и специфичности -диагностикума на примере исследовании сывороток крови здоровых и больных бруцеллезом животных. Как видно из таблицы 2, разработанный эритроцитарный диагностикум обладает высокой 4 специфичностью, т.к. не вступает в реакцию с гетерологичными и негативной сыворотками и высокой чувствительностью - предельный титр специфических антител выявляемых в исследуемой гомологичной позитивной сыворотке составляет 1 25600. Таким образом, в результате использование для нагрузки эритроцитов отитрованного ранее сенситина(-антигена) в количестве 2,5 см 3 на 1 см 3 5 взвеси эритроцитов, извлеченного из бактериальной клетки путем замораживания, оттаивания и последующего ультразвукового разрушения целостности микробных клеток В. 63290,позволяет готовить высокоактивный и специфичный -бруцеллезный эритроцитарный диагностикум. Эритроцитарный -диагностикум был испытан на чувствительность и специфичность путем исследования 176 проб сывороток крови крупного и 96 мелкого рогатого скота, а также 30 проб молока,доставленных из различных по эпизоотическому состоянию хозяйств и частных секторов сельских округов Костанайской области. В результате из 176 проб сыворотки крови крупного рогатого скота в 3(1,7) случаях было регистрировано положительные показания в РНГА, которые были подтверждены молекулярно-генетическим методом в ПЦР. Из 96 проб сыворотки крови мелкого рогатого скота в 2 (2,1) случаях регистрированы положительные показания в РНГА. При этом показания РНГА совпали с ПРА и РДСК с овисными антигенами, из которых все 2 случая подтверждены молекулярно-генетическим методом в ПЦР. Из 30 исследуемых проб молока в РНГА с разработанным антигеном положительно реагировали 3. Специфичность эритроцитарного -диагностикума подтверждена отрицательными показаниями РНГА при исследовании сывороток крови 226 здоровых животных крупного и мелкого рогатого скота. В дальнейшем эритроцитарный -диагностикум был испытан на чувствительность и специфичность путем исследования 236 проб сывороток крови крупного рогатого скота из благополучного по бруцеллезу хозяйства ТОО Байсерке-Агро село Аркабай Талгарского района с/о Панфиловский Алматинской области. При этом показания РНГА были негативными во всех случаях, что говорит о специфичности разработанного диагностикума. Диагностическая эффективность эритроцитарного-диагностикума также была изучена исследованием 114 проб сывороток крови крупного и 286 мелкого рогатого скота, привезенных из хозяйства ПК Шанак,Шанакского сельского округа,Казыгуртского района Южно-Казахстанской области. При этом показания РНГА были положительными у 4 голов крупного и 6 мелкого рогатого скота. Бактериологическим высевом из органов убитых 3 голов мелкого рогатого скота изолированы эпизоотические культуры бруцелл, положительно реагировавшим в РНГА. Таким образом, были определены оптимальные условия и количественные параметры компонентов,используемых при нагрузке формалинизированных эритроцитов специфическим сенситином, а также изучена диагностическая эффективность эритроцитарного -диагностикума. Диагностическая эффективность эритроцитарного -диагностикума. Пример 4. Диагностическая оценка РНГА. Реакцию считают положительной при наличии гемагглютининов с сывороткой крови не вакцинированных животных против бруцеллеза в следующих показателях для крупного рогатого скота в разведении сыворотки 1100 и выше, для овец и коз 150 и выше с оценкой 4 или 3 креста. При выявлении среди не вакцинированного против бруцеллеза крупного рогатого скота, сыворотки крови, которых дают положительную реакцию в разведении 150, а овец и коз - 125, их считают сомнительно реагирующими и обследуют повторно через 15-30 суток в РНГА. При повышении титров в РНГА заболевание считается установленным при сохранении прежних титров в РНГА животных признают здоровыми. Использование способа получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации позволит выявить животных, зараженных диссоциированными формами бруцелл. Таблица 1 Результаты проверки активности и специфичности -бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в РНГА-положительная Негативная Негативная Гетерологичные сыворотки Результаты исследования сыворотки крови в РНГ А ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации,включающий изготовление -антигена из штамма бруцелл путем механического разрушения растиранием выпавших в осадок после центрифугирования микробных клеток и сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана оттитрованным качестве -антигена используют штаммВ-0176,который предварительно подвергают замораживанию при температуре -20 С, после чего оттаиванию с последующим воздействием на бруцеллезную взвесь ультразвуковых волн частотой 22 кГц и мощностью 90 Вт/см 2 трехкратно в течение 15 минут, затем озвученную бактериальную взвесь подвергают центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 минут, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость используют в качестве целевого продукта.