Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при эхинококкозе

(51) 61 39/00 (2006.01) А 61 К 35/18 (2006.01) 01 33/53 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ включает приготовление формалинизированных эритроцитов последующую их обработку додецилсульфатом натрия в 1-ной концентрации при 50-60 С в течение 30 мин, сенсибилизацию сенситином, полученным путем выделения зрелых члеников цестоды, их разрушения, выделения онкосфер, их культивирования, получения проценурусов, с последующей их обработкой ультразвуком при 20-24 кГц в течение 10-15 минут, установкой рН 8,0-9,0,автоклавированию при 1 атмосфере (120 С) в течение 20-30 мин., охлаждению до температуры 1825 С и центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Способ позволяет получить специфичный и активный эхинококкозный эритроцитарный антиген для РНГА.(76) Каташева Жанат Чамаевна , Сабаншиев Мажит Сабаншиевич(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ ЭХИНОКОККОЗЕ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к приготовлению диагностических препаратов, в частности к способу получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при диагностике эхинококкоза животных. 21668 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к приготовлению диагностических препаратов, в частности к способу получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при диагностике эхинококкоза животных. Аналогов в патентной и научно-технической литературе не обнаружено. Технической задачей изобретения является разработка способа получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации(РНГА), который обладает высокой активностью и дает возможность обнаружить зараженных эхинококкозом животных наиболее полно и в более ранние сроки после заражения. Поставленная цель достигается тем, что 1. Формалинизированные эритроциты для повышения адсорбционных свойств их рецепторов предварительно до сенсибилизации обрабатываются новым детергентом - додецилсульфатом натрия при оптимальном режиме - в 1-ной концентрации при 50-60 С в течение 30 мин. 2. С целью определения оптимальной дозы сенситина, требуемого для сенсибилизации эритроцитов и получения стандартного антигена для РНГА, используется стандартный образец противоэхинококкозной сыворотки. 3. Сенситин получают путем выделения зрелых члеников цестоды, их разрушения, выделения онкосфер, их культивирования,получения протоэхинококков, с последующей их обработкой ультразвуком при 20-24 кГц в течение 1015 минут, установкой рН 8,0-9,0, автоклавированию при 1 атмосфере (120 С) в течение 20-30 мин., охлаждению до температуры 18-25 С и центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Зрелые членики цестоды,наполненные яйцами и содержащие онкосферы,получают от экспериментально зараженных собак. Членики разрушают механическим путем и отмывают яйца путем центрифугирования в физиологическом растворе поваренной соли при 1000 об/мин в течение 5 минут, дважды. Отмытые яйцапоследовательно подвергают обработке искусственным желудочным соком (0,35 соляной кислоты, 0,15 пепсина), а затем искусственным кишечным соком(5 едкого натрия, 0,1 панкреатина). При этом на каждые 100 тыс. яицрасходуют по 5 мл, обработку искусственным желудочным соком осуществляли в течение 1,5-2 ч, а кишечным соком 15-20 минут при температуре 3738 С. После обработки желудочным соком яйцаотмывают путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 минут в физиологическом растворе натрия хлорида, а после обработки кишечным соком, освободившиеся онкосферы - средой культивирования. Отмытые онкосферы помещают в среду культивирования, из расчета на 100 тыс. онкосфер 40-50 см 3,в которой происходит культивирование в течение 4850 часов при температуре 37-38 С. Среду культиви 2 рования готовят из следующих ингредиентов, мл нативная сыворотка 2-3-месячных телят, 50 см 3(10) бензилпенициллина калиевая соль 0,15 см 3(0,5 г сухого вещества разводят в 10 см 3 среды 199) 0,03 стрептомицина сульфат 0,1 см 3 (0,5 г сухого вещества разводят в 10 см 3 среды 199) - 0,02 и среда 199 -остальное до 500 см 3. По истечении срока культивирования онкосферы превращаются в проэхинококки, количество которых доводят до 2000100 экземпляров в 1 см 3 среды. С целью усиления антигенных свойств проэхинококки подвергают обработке ультразвуком при 20-24 кГц в течение 10-15 минут. Устанавливают рН 8,0-9,0 и подвергают ультразвуковой лизат автоклавированию при 1 атмосфере (120 С) в течение 20-30 мин., затем остужают до температуры 18-25 С и подвергают центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Полученный лизат (сенситан) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом додецилсульфатом натрия в 1-ной концентрации при температуре 50-60 С в течение 30 мин. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов после обработки додецилсульфатом натрия проводится оптимальной дозой сенситина, которая определяется путем титрации его с использованием стандартного образца противоэхинококкозной сыворотки. Специфичность и активность готового эритроцитарного антигена проверяются путем исследования в РНГА отрицательной сыворотки и стандартного образца противоэхинококкозной сыворотки. Пример определения оптимальных условий обработки формалинизированных эритроцитов додецилсульфатом натрия и сенсибилизации их сенситином(липополисахаридобелковый комплекс). Определение оптимальной концентрации додецилсульфата натрия, требуемой для повышения адсорбционных свойств эритроцитов и получения специфичного и активного эритроцитарного антигена для РНГА, проводится путем обработки 10 взвеси формалинизированных эритроцитов разными концентрациями (1,0 1,5,) додецилсульфата натрия и проверки активности и специфичности в РНГА антигена, полученного путем сенсибилизации эритроцитов, обработанных разными концентрациями указанного детергента. Оптимальную сенсибилизирующую дозу сенситина, необходимую для получения стандартного антигена для РНГА с оптимальной активностью, определяют путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов (предварительно обработанных додецилсульфатом натрия) возрастающими дозами сенситина и проверки серологической активности сенсибилизированных эритроцитов (антигена) в РНГА с использованием стандартного образца противоэхинококкозной сыворотки. Для сенсибилизации эритроцитов к 1 см 3 5-ной их взвеси добавляют по 0,5 1,0 1,5 2,0 см 3 сенситина. Результаты проверки активности и специфичности антигена, полученного при обработке эритроцитов разными концентрациями додецил сульфата натрия и сенсибилизированных разными дозами сенситина, даны в таблице 1. 21668 Таблица 1 Результаты титрации сенситина и проверки активности эритроцитарного антигена в РНГА К-во сенситина на 1 см 3 5- взвеси эритроцитов Титры РНГА со стандартным образцом с негативной сывороткой с физпротивоэхинококкозной сыворотки раствором 1200 1400 1800 11600 13200 1640 150 1100 120 1400 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А) с антигеном, изготовленным без обработки эритроцитов додецилсульфатом натрия 1,0 Б) с антигеном, изготовленным путем обработки эритроцитов 1 -ной концентрацией додецилсульфата натрия 1,0. В) с антигеном, изготовленным путем обработки эритроцитов 1,5-ной концентрацией додецилсульфата натрия 1,0 Примечание знак (-) - отрицательный результат , ,- степень положительного результата. Из приведенных в таблице 1 данных видно, что антиген, изготовленный путем сенсибилизации эритроцитов, не обработанных додецилсульфатом натрия, обладает низкой активностью. Обработка эритроцитов додецилсульфатом натрия повышает активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки эритроцитов является 1-ная концентрация додецилсульфата натрия,позволяющая получить эритроцитарный антиген,обладающий достаточно высокой активностью и не дающий неспецифические реакции с негативной сывороткой и физраствором. Наименьшей дозой сенситина, позволяющей получить антиген с достаточно высокой активностью, является 1,0-1,5 см 3 его на 1 см 3 5-ной взвеси формалинизированных эритроцитов, предварительно обработанных детергентом. Следовательно, обработка эритроцитов 1,0-ной концентрацией додецилсульфата натрия и сенсибилизация их, из расчета 1,5 см 3 сенситина на 1 мл 5-ной взвеси эритроцитов, позволяет получить специфичный и активный эхинококкозный эритроцитарный антиген для РНГА (табл.2). Таблица 2 Результаты испытания специфичности эритроцитарных антигенов Сыворотки, крови, подвергнутые исследованию здоровых по эхинококкоз овец больных эхинококкозом овец больных ценурозом овец (подтверждено патологанатомически) больных по бруцеллезу овец (подтверждено серологически) больных эпидидимитом баранов (подтверждено серологически) больных кишечными стронгилятозами ягнят(подтверждено патологанатомически) Больных эстрозом овец (подтверждено патологанатомически) Всего исследовано 21668 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при эхинококкозе, включающий приготовление формализированных эритроцитов, обработку их додецилсульфатом натрия в 1-ной концентрации при 5060 С в течение 30 мин с последующей сенсибилизацией сенситином полученным путем выделения зрелых члеников цестоды, их разрушения, выделения онкосфер, их культивирования, получения проэхинококков, с последующей их обработкой ультразвуком при 2024 кГц в течение 10-15 минут, установкой рН 8,09,0, автоклавированием при 1 атм. (120 С) в течение 20-30 мин., охлаждением до температуры 18-25 С и центрифугированием при 8-10 тыс., оборотов в минуту.