Способ приготовления антительного эритроцитарного бруцеллёзного диагностикума для индикации специфического антигена в реакции непрямой гемагглютинации

(51) 61 10/00 (2006.01) 61 39/10 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ антительного эритроцитарного бруцеллезного диагностикума для индикации специфического антигена в реакции непрямой гемагглютинации. Способ приготовления антительного эритроцитарного бруцеллезного диагностикума для индикации специфического антигена в реакции непрямой гемагглютинации, путем сенсибилизации формалинизированных трипсинизированных эритроцитов барана бруцеллезной сывороткой, в качестве носителя сенситина,используют формалинизированные эритроциты в 5-ной концентрации, обработанные свежеприготовленным 0,2 раствором глутарового альдегида в соотношении 21 соответственно, при температуре 20 С, которую взбалтывают, приливают 1 объем антифаговой сыворотки в разведении 150 соответственно, и помещают в водяную баню на 60 минут при температуре 56-58 С, при этом сенсибилизированные эритроциты отмывают 0,85 физиологическим раствором 7,0 на центрифуге при 1500-2000 об/мин в течение 10 минут двукратно и получают целевой продукт.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Султанов Ахметжан Акиевич Оспанов Ержан Калиолдинович Шманова Балымзия Тастановна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Рекомендации по приготовлению эритроцитарных антительных диагностикумов для индикации бруцелл. Алма-Ата Кайнар, 1989, с.8(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АНТИТЕЛЬНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО БРУЦЕЛЛЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ(57) Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к лабораторной диагностике бруцеллеза животных и может быть использовано в ветеринарной микробиологии и иммунологии. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении эффективного Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к лабораторной диагностике бруцеллза животных и может быть использовано в ветеринарной микробиологии и иммунологии. Известен способ получения антительного эритроцитарного диагностикума путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана антителами с помощью конъюгирующего агента - амидола Приготовление эритроцитарных антительных диагностикумов для индикации бруцелл (Рекомендации). - Кайнар,Алма-Ата 1989.- с. 8. Недостатком известного способа приготовления антительного эритроцитарного бруцеллзного диагностикума для индикации специфического антигена является невысокая чувствительность и специфичность иммунологического реагента. Задачей изобретения является приготовление высокочувствительного и специфичного антительного эритроцитарного бруцеллзного диагностикума для индикации специфического антигена в реакции непрямой гемагглютинации. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении эффективного антительного эритроцитарного бруцеллзного диагностикума для индикации специфического антигена в реакции непрямой гемагглютинации. Способ приготовления антительного эритроцитарного бруцеллзного диагностикума для индикации специфического антигена в реакции непрямой гемагглютинации, путем сенсибилизации формалинизированных трипсинизированных эритроцитов барана бруцеллзной сывороткой, в качестве носителя сенситина,используют формалинизированные эритроциты в 5-ной концентрации, обработанные свежеприготовленным 0,2 раствором глутарового альдегида в соотношении 21 соответственно, при температуре 20 С, которую взбалтывают, приливают 1 объем антифаговой сыворотки в разведении 150 соответственно, и помещают в водяную баню на 60 минут при температуре 56-58 С, при этом сенсибилизированные эритроциты отмывают 0,85 физиологическим раствором 7,0 на центрифуге при 1500-2000 об/мин в течение 10 минут двукратно и получают целевой продукт. Изобретение осуществляют следующим образом. Для приготовления эритроцитарного диагностикума используют бруцеллезный фаг Тб выделенный грузинскими исследователями М.З.Попхадзе и Т.Г.Абашидзе в 1955 г. из сточных вод коровника на ферме крупного рогатого скота,неблагополучного по бруцеллзу, который после селекционирования приобрел стабильные высоколитические свойства в отношении В. и хранится в рабочей коллекции Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки вириона. Бруцеллзный фаг Тб гексагональной формы размером 605 нм, длина отростка 162 нм. Культуральные свойства. Для адсорбции литического фага Тб необходим контакт с бруцеллзной клеткой не менее 6-9 часов при температуре не выше 10 С. Лизис клеток и выход фага в жидкую среду наблюдают через 12- 24 часов при 37 С. Примерно в эти же сроки наблюдают и появление прозрачных круглых бляшек лизиса, с гладкими краями, на агаровой культуре бруцелл размером от 0,5 до 3-4 мм. Концентрация фаговых частиц при оптимальных условиях культивирования достигает через 24-48 часов 10-9- 10-10 БОЕ/см 3 бульона. Антигенные свойства. Диапозон литической активности фага Тб определяют по отношению к музейным штаммам бруцелл в- форме В.16-М.,544 и 1330. Процесс взаимодействия фага Тб с клеткой В.ограничивается только фазой адсорбции. На клетках В. адсорбция фага Тб практически не происходит. Стабильность свойств при пассировании. Для поддержания и размножения фага применяют слабовирулентный штамм В. 19, который обеспечивает оптимальные условия репродукции вируса,характеризуется низкой частотой образования фагоустойчивых мутантов,высокоустойчив к диссоциации, сохраняетформу колонии при многократных пересевах на питательных средах. При взаимодействии бруцеллзного фага Тб с бруцеллами вида , в частности В. 19 наблюдают все фазы взаимодействия вируса с клеткой. Сохраняемость. В нативном состоянии не снижает активности в течение года на жидких питательных средах (мясо-пептонный бульон,бульон Мартена) при температуре 4-6 С. Пример 1. Стабилизация эритроцитов формальдегидом. Для приготовления эритроцитарного диагностикума используют дифибринированную кровь барана, которую центрифугируют при 15002000 об/мин с экспозицией 10 минут. Полученный осадок эритроцитов трижды отмывают 0,85 физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500-2000 об/мин в течение 20 минут. Из осадка готовят 8 взвесь эритроцитов на физиологическом растворе. К 150 см 3 8 взвеси эритроцитов капельно добавляют при постоянном перемешивании равный объем изотонического раствора формалина ( 7-7,2), содержащего 3 формальдегида. Смешивание происходит на магнитной мешалке, после чего смесь помещают в термостат при 37-38 С на 16 часов. По истечении времени выдерживания в термостате формалинизированные эритроциты фильтруют через 2-3 слоя рыхлой ваты и трижды отмывают центрифугированием десятикратным объемом физиологического раствора при 1500 об/мин по 10 минут. После осаждения эритроцитов из осадка готовят 20 взвесь на буферно-физиологическом растворе, содержащем 0,1 раствора азида натрия. Пример 2. Обработка эритроцитов формалином. Для этого 12,5 взвесь эритроцитов в физиологическом растворе помещают в соответствующий сосуд,куда опускают целлофановый мешок, содержимое которого представляет формалин, взятый в объеме,составляющем 20 по отношению к объему взвеси эритроцитов сосуд встряхивают в шюттельаппарате 2 часа в течение этого времени формалин в небольшом количестве проникает во взвесь эритроцитов через поры целлофана после указанного срока иглой производят прокол целлофанового мешка, а встряхивание продолжают еще 2 часа, затем остаток содержимого целлофанового мешка смешивают со взвесью эритроцитов и встряхивание продолжают еще 12-14 часов. Взвесь формалинизированных эритроцитов(шоколадного цвета) фильтруют через 4 слоя марли,эритроциты промывают в центрифуге 6 раз 10 кратным объемом физиологического раствора и осадок эритроцитов смешивают с равным объемом изотонического раствора поваренной соли. Все процедуры, за исключением встряхивания производят при 4-5 С. Пунктуальное выполнение описанной методики позволяет получить равномерную взвесь эритроцитов, не содержавшую комков. В процессе формалинизации, фильтрования через марлю, многократного промывания потери эритроцитов составляли 15-25. После осаждения эритроцитов из осадка готовят 20 взвесь на буферно-физиологическом растворе, содержащем 0,1 раствора азида натрия. Пример 3. Обработка формалинизированных эритроцитов конъюгантом. Формалинизированные эритроциты в 5 концентрации обрабатывают свежеприготовленным 0,2 раствором глутарового альдегида в соотношении 21 соответственно, при температуре 20 С. Пример 4. Очистка и концентрирование бруцеллзных фагов. Очистку и концентрирование бруцеллзных фагов, для получения антифаговой сыворотки, с высоким титром, осуществляют путм осаждения полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000. При этом получают 50 - кратные фаговые концентраты, то есть титр их биологической активности превышают 10-10. Пример 5. Получение иммунных сывороток. Для получения антифаговых сывороток кроликам в области нижней части четырех лапок подкожно вводят бактериофаг общим объемом 5,0 см 3 и с титром 10-12 и выше. Один цикл состоит из 5 инъекций с интервалом 3 суток. Одновременно с введением фага инокулируют Т- и В- активин или риботан в 1,2 и 15 сутки после начала иммунизации. По окончанию цикла иммунизации проводят пробное взятие крови из краевой вены уха. Полученную сыворотку исследуют в реакции нейтрализации. Приготовленная по описанной выше методике антифаговая сыворотка в разведении 150 и 1100 полностью нейтрализует за 15 минут корпускулы гомологичного фага. Затем через 8 суток после последней иммунизации кроликов обескровливают и получают гипериммунную сыворотку путем отстаивания. Пример 6. Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов специфической сывороткой. С целью повышения чувствительности препаратов формалинизированные эритроциты перед сенсибилизацией обрабатывают трипсином. При этом их в виде 20-ной взвеси на 0,15 М буфернофизиологическом растворе 7,2 инкубируют с равным объемом 0,025-ного раствора трипсина в течение часа при температуре 37 С, затем трижды отмывают и готовят рабочую взвесь. Обработка эритроцитов трипсином повышает чувствительность реакции в среднем 300 раз. Для сенсибилизации эритроцитов используют антифаговые сыворотки, разведенные 0,85 физиологическим раствором 150. Смешивание компонентов проводят в следующем порядке(эритроцитыглутаровый альдегид)сыворотка. Оптимальными параметрами условий сенсибилизации эритроцитов антифаговыми сыворотками являются следующие берут 2 объема 5 взвеси формалинизированных эритроцитов,добавляют 1 объем 0,2 водного раствора глутарового альдегида и 1 объем антифаговой сыворотки в разведении 150. Полученную смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 58 С в водяной бане. Сенсибилизированные эритроциты отмывают 0,85 физиологическим раствором 7,0 на центрифуге при 1500-2000 об/минуту в течение 10 минут двукратно и получают целевой продукт. Пример 7. Консервирование сенсибилизированных эритроцитов. В случаях использования диагностикумов в течение 1-2 месяцев после приготовления для консервации применяют 0,1 раствор азида натрия. При длительном хранении диагностикумов, их консервацию проводят следующим образом первоначально отмывают 0,1 раствором азида натрия (5-10 - кратным объемом) на центрифуге при 1500-2000 об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок покрывают глицерином и хранят при 4 С. При последующем применении консервированных диагностикумов их отмывают от глицерина физиологическим раствором,ресуспензируют этим же раствором до изначальной концентрации. Эритроциты,обработанные описанным способом сохраняются при 4 С не менее одного года, не лизируются в гипотоническом растворе поваренной соли и практически не обладают способностью агглютинироваться гетерогеными антигенами. Пример 8. Подготовка материала для исследований в реакции непрямой гемагглютинации В качестве антигена для исследований в РНГА используют суспензии из органов убитых больных животных, абортированных плодов, молоко, мочу,различные смывы с объектов внешней среды. Пробы навоза, почвы и других объектов внешней среды заливают физиологическим раствором в соотношениях 110, фильтруют через бумажный фильтр и центрифугируют 30 минут при 5000 об/мин. После чего фильтруют через керамический фильтр с диаметром пор 120-150 нм или систему Стерифил . Полученный таким образом фильтрат исследуют на наличие в нем бруцеллзных бактериофагов. Подготовку материала из органов убитых зараженных животных и абортированных плодов осуществляют следующим образом кусочки органов зараженных животных измельчают в ступках с физиологическим раствором поваренной соли. Затем центрифугируют при 5000 об/минуту в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливают и разводят физиологическим раствором поваренной соли в соотношении 110 и пропускают через керамический фильтр с диаметром пор 120-150 нм или систему Стерифил . Полученный фильтрат используют в качестве антигена в РНГА. Предварительное осуществление подготовки проб способствует более эффективному установлению факта наличия или отсутствия в них бактериофагов. Пример 9. Проверка на активность и специфичность антительного эритроцитарного диагностикума. Активность и специфичность антительного эритроцитарного диагностикума проверяют в РНГА. Реакцию ставят макрометодом в объеме 0,5 см 3 в полистироловых планшетах с бруцеллзными и гетерологичными фагами(бруцеллзный,сальмонеллзный,колибактериозный, пастереллзный). В качестве разбавителя применяют твин-80 в разведении 15000. Контролем к реакций служат бактериофаг танизированные трипсинизированные несенсибилизированные эритроциты- твин-80 в разведении 15000 танизированные трипсинизированные сенсибилизированные эритроциты- физиологический буферный раствор (РН-7,2)танизированные трипсинизированные несенсибилизированные эритроциты. Результаты чувствительности и специфичности приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, приготовленный антительный эритроцитарный диагностикум позволяет выявлять бруцеллзные фаги в титре 10-2 или до 5-10 фаговых корпускул в 1 см 3 суспензии,при отрицательном контроле (суспензия из органов здорового животного и гетерологичные фаги), что свидетельствует о его высокой чувствительности и специфичности. Применение предлагаемого способа позволит обнаруживать специфические фаги в патологическом материале взятых от инфицированных бруцеллами животных, в воде, в навозной жиже и других объектах внешней среды,что имеет большое практическое значение для выяснения и оценки роли этих факторов в передаче возбудителя инфекций, который характеризует санитарно-эпизоотологическое состояние местности и будет свидетельствовать о инфицированности их бруцеллами,а также дает возможность своевременно принять соответствующие меры для недопущения дальнейшего распространения болезни. Таблица 1 Чувствительность и специфичность диагностикума в реакции непрямой гемагглютинации Минимальная гемагглютинирующая способность диагностикума антительного эритроцитарного (БОЕ/см 3) Наименование исследуемого материала Бруцеллезный фаг Тб Пастереллзный фаг Сальмонеллзный фаг Колибактериозный фаг 10-2 Суспензии из органов убитых больных животных Бруцеллзом Пастереллзом Сальмонеллзом Колибактериозом 10-2 Смывы с объектов внешней среды (пробы навоза, почвы) 10-2 Контроль реакций 1,- бактериофагитанизированные трипсинизированные несенсибилизированные эритроциты К 2 - физиологический буферный раствор (РН- 7,2)танизированные трипсинизированные несенсибилизированные эритроциты К 3-твин-80 в разведении 15000 4 Минимальная гемагглютинирующая способность диагностикума антительного эритроцитарного (БОЕ/см 3)танизированные трипсинизированные сенсибилизированные эритроциты К 4-суспензии из органов здоровых животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления антительного эритроцитарного бруцеллезного диагностикума для индикации специфического антигена в реакции непрямой гемагглютинации, путем сенсибилизации формалинизированных трипсинизированных эритроцитов барана бруцеллезной сывороткой,отличающийся тем, что в качестве носителя сенситина используют формалинизированные эритроциты в 5 - ной концентрации, обработанные свежеприготовленным 0,2 раствором глутарового альдегида в соотношении 21 соответственно, при температуре 20 С, которые взбалтывают, приливают 1 объем антифаговой сыворотки в разведении 150 соответственно, и помещают в водяную баню на 60 минут при температуре 56-58 С, при этом сенсибилизированные эритроциты отмывают 0,85 физиологическим раствором рН 7,0 на центрифуге при 1500-2000 об/мин в течение 10 минут двукратно и получают целевой продукт.