Штамм целлюлолитических бактерий bacillus cytaseus 21n, используемый для получения бактериального удобрения под донник

(51) 01 63/00 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) 05 11/08 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ 21 фиксирует молекулярный азот атмосферы и снабжает им растения. Также,предлагаемый штамм продуцирует биологически активные вещества (витамины группы В и аминокислоты),которые оказывают стимулирующий эффект на дальнейший рост и развитие растений. Заявляемый штамм,характеризуется высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам, взывающим корневые гнили, возбудителями которых являются грибы родов альтернария,гельминтоспориум, фузариум и другие. Применение штамма целлюлолитических бактерий В.21 для предпосевной обработки семян донника приводит к повышению урожая зеленой массы донника в среднем на 8,1 т/га по сравнению с контролем. Штамм В.21 не токсичен, не патогенен и не фитотоксичен, его использование экологически безопасно и соответствует требованиям охраны окружающей среды, поскольку основано на естественном взаимодействии организмов в природе, не приводит к загрязнению почвы и нарушению биологического равновесия, так как целлюлолитические бактерии являются полезными представителями микрофлоры почвы,которые участвую в процессе почвообразовании. Применение штамма в качестве бактериального удобрения дает возможность избежать применения химических удобрений и стимуляторов роста растений,нарушающих систему почва-растение-потребитель и ухудшающих качество продуктов питания.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Смирнова Ирина Эльевна(56) Инновационный патент РК 24974, кл. 01 63/00, 2012 г 21,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД ДОННИК(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к бактериальным удобрениям растений, и может быть использовано для повышения всхожести семян, стимуляции роста и защиты сельскохозяйственных растений. Получен штамм целлюлолитических бактерий 21 для использования в качестве бактериального удобрения растений, отличающийся тем, что обладает способностью эффективно повышать всхожесть семян, стимулировать рост и развитие донника, и защищать растения от фитопатогенных грибов, вызывающих корневые гнили. Способность штамма В.21 повышать всхожесть семян, обусловлена синтезом ферментов целлюлаз, которые частично деградируют твердую оболочку донника и, тем самым, ускоряются доступ воды и растворенных в ней минеральных и питательных веществ к эндосперму зародыша семени. Эффективное ростостимулирующее влияние связано с тем, что предлагаемый штамм В. Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к бактериальным удобрениям растений, и может быть использовано для повышения всхожести семян, стимуляции роста и защиты сельскохозяйственных растений. Известно микробиологическое удобрение на основе грибов арбускулярной микоризы ( грибы) и бактерий (клубеньковые бактерии и ризобактерии) и природного биосовместимого носителя (Патент РФ 2318784, 12 1/20 0511/08, опубл. 2008). Недостатком является то, что микробиологическое удобрение применяется только для микоризующихся сельскохозяйственных растений,таких как сорго, суданская трава, сорго-суданковый гибрид и просо. Кроме того, в состав удобрения входят микроорганизмы, которые требуют для культивирования дорогостоящие питательные среды, что значительно удорожает применение микробиологического удобрения. Известно бактериальное удобрение растений, на основе штаммов бактерийи. для стимуляции роста и развития смешанного бобово-злакового посева (Патент РФ 2439880, 01 63/00 12 1/20 12 1/41 12 1/20, опубл. 2011). Недостатком этого состава штаммов бактерий является то, что он стимулирует рост и развитие только люпина и ячменя в смешанных люпино-ячменных посевах и не пригоден для стимуляции роста и развития других растений. Наиболее близким прототипом является ассоциация бактерийВКПМ В-4441 иВКПМ В-4465 для симуляции роста и защиты сельскохозяйственных растений, в том числе донника, от фитопатогенных грибов.(Инновационный патент РК 24974, 01 63/00 С 12 1/20 С 12 139, опубл. 2012). Недостатком является то, что для получения бактериальной ассоциации,культуры микроорганизмов необходимо выращивать отдельно на питательных средах, что значительно удорожает способ и удлиняет сроки приготовления ассоциации. Кроме того,ассоциация штаммов характеризуется незначительным повышением всхожести семян донника. Задачей изобретения является получение нового штамма бактерий для бактериального удобрения растений, обладающего способностью повышать всхожесть семян, стимулировать рост и защищать растения донника от фитопатогенных грибов,вызывающих корневые гнили. Получен штамм целлюлолитических бактерий 21, эффективно повышающий всхожесть семян донника за счет синтеза ферментов целлюлаз,биологически активных веществ(витамины группы В, аминокислоты) и способности штамма фиксировать молекулярный азот атмосферы. Штамм целлюлолитических бактерий 21, характеризуется высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам,взывающим такие заболевания как альтернариоз, гельминтоспориоз,фузариоз. 2 Предлагаемый штамм выделен из разлагающейся древесины с последующей селекцией активного варианта на жидких и твердых средах Гетчинсона,агаризованном отваре соломы (соломенный агар). Культуру выращивают и хранят на косяках с соломенной средой следующего состава 241,0 СаС 2-0,1 4-0,3 3-2,5 -0,1 3-0,01 пшеничная солома-20 дрож. экстракт 1,0, агар-7, вода водопр.-1 л. Температура хранения 5 С, пересев через 3 месяца. Для культивирования штамма используют среды МПА или Гетчинсона. Состав среды Гетчинсона (г) К 2 НРО 4-1,0 СаС 2-0,1 4-0,3 3-2,5 0,1 3-0,01 глюкоза-10 дрож. экстракт-1,0 вода водопр.-1 л. Температура 28-30 С. Штамм депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК. Копия справки о депонировании прилагается. Характеристика штамма 21 Штамм 21 , характеризуется следующими культурально-морфологическими и биохимическими признаками. Грамположительные палочки 2,50,55,00,8 мкм, располагаются поодиночке, парами и короткими цепочками. Перетрих. Центральнорасположенные овальные споры 0,5-0,8 мкм в диаметре, форма клеток при спорообразовании не изменяется. Колонии белые или светло-серые, от гомогенных до зернистых, край лопастной, диаметр 2-4 мм. Факультативный анаэроб. Растет в широком диапазоне значений рН (4,0-9,0), лучше в нейтральном, хорошо развивается в кислой среде. Температура роста от 15 до 45 С и выше, с оптимумом 28-30 С. Споры термостойки. Рост на синтетических средах хороший. Рост на МПБ - помутнение среды умеренное,однородное, пленка сплошная, тонкая, рыхлая,складчатая,осадок обильный,рыхлый,хлопьевидный. Рост на МПА колонии округлые,поверхность складчатая, край волнистый или лопастной. Цвет колонии белый или светло-серый,колонии непрозрачные, пигмент в среду не выделяется. Структура колоний от гомогенной до зернистой, консистенция тестообразная. Способность к эмульгированию - равномерная суспензия в воде. Физиолого-биохимические признаки. Использует следующие углеводы глюкозу, декстрозу, мальтозу,фруктозу с образованием кислот, а также арабинозу,галактозу, ксилозу, лактозу, сахарозу, маннит с подщелачиванием среды. Крахмал гидролизует, аммиак образует, индол,сероводород не образует. Желатину разжижает. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу. Вызывает подщелачивание и протеолиз молока. Растет на синтетических средах, используя в качестве источника азота нитраты, нитриты,аммонийные соли, не требует внесения в среду витаминов или других факторов роста. Хорошо растет на белковых формах азота и пептоне. Может расти на безазотистых средах,фиксируя молекулярный азот атмосферы. Штамм синтезирует целлюлолитические ферменты эндо-1,4 -глюканаза-8-9 ед/г целлобиаза- 35-36 ед/г. Активность целлюлаз определяли по образованию редуцирующих сахаров под действием ферментов на целлюлозосодержащие субстраты модифицированным методом Шомоди-Нельсона(Клесов и др., 1980). Штамм В.21 , характеризуется способностью фиксировать молекулярный азот атмосферы. На безазотистых средах фиксация азота составляет 15,610-5-60,210-5 мг 2/мл среды/ч в зависимости от источника углерода. Культуру выращивают и хранят на косяках с 0,7 соломенного агара. Температура хранения 5 С, пересев через 3 месяца. Для культивирования штамма используют среды МПА или Гетчинсона. Состав среды Гетчинсона приведен выше. Температура 28-30 С, время культивирования - 48 ч. Заявляемый штамм не токсичен и не патогенен для человека и животных и не обладает фитотоксичностью (не подавляет всхожесть семян,не ингибирует развитие корней, плодов и зеленой массы растений). Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером. Пример 1. Штамм В.21 выращивают на среде Гетчинсона (состав среды приведен выше) с пшеничной соломой в качестве источника целлюлозы на качалке при 28-30 С и 180-200 об/мин до концентрации 1106-1108 кл/мл. Семена донника перед посевом обрабатывают суспензией целлюлолитических бактерий в концентрации 1106 клеток на 1 г семян в течение 6-8 ч при температуре 20-25 С. Обработанные семена высевают в течение 10-30 ч, оберегая от высыхания. В контроле семена замачивают в водопроводной воде. Затем раскладывают на чашки Петри с агаризованной средой Ковровцева и оставляют для проращивания при комнатной температуре. Через 7 суток проводят подсчет проростков растений, измерение надземной части и корней. Показано, что всхожесть семян донника возросла по сравнению с контролем и прототипом. В варианте со штаммом В.21 всхожесть семян составляет 74,8, у прототипа 70,2. Разница между результатами опыта и прототипа достоверна с вероятностью р 0,05 и составляет 4,6 (превышение на 6,5). Длина стебля проростков обработанных семян также превышала длину проростков прототипа на 23,7, корней - на 26 (табл. 1). Положительное влияние обработки семян штаммом В.21 обуславливается способностью синтезировать ферменты целлюлазы,которые частично деградируют твердую оболочку донника и, тем самым, ускоряются доступ воды и растворенных в ней минеральных и питательных веществ к эндосперму зародыша семени. Эффективное ростостимулирующее влияние связано с тем, что предлагаемый штамм В.21 фиксирует молекулярный азот атмосферы и снабжает им растения (табл. 2). Также,преимуществом данного штамма является то, что штамм способен синтезировать биологически активные вещества, такие как витамины группы В и аминокислоты, которые оказывают дополнительный стимулирующий эффект на рост и развитие проростков донника (табл. 3 и 4). Пример 2. Антагонистическую активность штамма В.21 определяют по зонам угнетения роста фитопатогенных грибов. Тесткультуры фи-топатогенных микроорганизмов засевают глубинным способом на среду Чапека-7 для грибов, охлажденной до 38-40 С и разливают в чашки Петри. После застывания агара из среды вырезают блоки. В полученные лунки заливают суспензию клеток ассоциации с концентрацией 1106 кл/мл из расчета 0,2 мл в каждую лунку. Чашки инкубируют при температуре 28-30 С в термостате в течение шести и более суток. Учет результатов проводят по величине зон подавления роста тест-культур. Полученные данные свидетельствуют о высокой антагонистической активности штамма В.2 в отношении большого ряда фитопатогенных грибов, . ,,-, . ,. , .., .. , . , . , , вызывающих альтернариоз,гельминтоспориоз, фузариоз сельскохозяйственных растений (табл. 5). Пример 3. Семена донника сорта Калдыбанский перед посевом обрабатывают суспензией целлюлолитических бактерий В.21 из расчета 15-20 мл препарата (титр 11051106 кл/мл) на 1 кг семян. Обработанные семена высевают в полевых условиях порционной сеялкой СК-2 в почву в течение 10-30 ч, оберегая от высыхания. Норма высева семян 12-13 кг/га,глубина - 4-5 см. Контролем служат необработанные семена (табл. 6). Полевые опыты показывают, что обработка семян донника штаммом В.21 увеличивает густоту всходов, кустистость растений и положительно влияет на показатели структуры урожая. Количество всходов в варианте, где семена обработывают штаммом В.21 , составляет в среднем 149 шт./м, в то время как в контроле только - 82 шт./м, растения имеют большую высоту растений, которая составляет 63 см, в контроле - 46 см. Установлено, что вес зеленой массы донника с 1 га посевной площади в варианте со штаммом В.21 значительно взрастет и составляет 12,8 т/га, в контроле только - 4,7 т/га. Таким образом,получен штамм целлюлолитических бактерий 21 ,который можно использовать в качестве бактериального удобрения, характеризующийся способностью активно повышать всхожесть растений донника, стимулировать дальнейший рост и развитие проростков, а также применять штамм для защиты растений донника от фитопатогенных 3 грибов,вызывающих корневые гнили. Использование штамма целлюлолитических бактерий В.21 для предпосевной обработки семян донника приводит к повышению урожая зеленой массы донника в среднем на 8,1 т/га по сравнению с контролем. Штамм В.21 не токсичен, не патогенен и не обладает фитотоксичностью, его использование экологически безопасно и соответствует требованиям охраны окружающей среды, поскольку основано на естественном взаимодействии организмов в природе, не приводит к загрязнению почвы и нарушению биологического равновесия, так как целлюлолитические бактерии являются полезными представителями микрофлоры почвы,которые участвую в процессе почвообразовании. Применение штамма в качестве бактериального удобрения дает возможность избежать применения химических удобрений и стимуляторов растений,нарушающих систему почва-растение-потребитель и ухудшающих качество продуктов питания. Производство биомассы целлюлолитических бактерий для практического применения может быть налажено на основе простых сред, содержащих в качестве источника углерода пшеничную солому,и не требует использования факторов роста. Способность штамма к спорообразованию обеспечивает его сохранность на длительный период времени как в виде активного биопрепарата,так и в природе в составе микробиоты почвы, что улучшает ее плодородие в последующие после внесения годы. Таблица 1 Стимулирующее влияние целлюлолитических бактерий .21 на всхожесть семян и развитие проростков Варианты опыта Контроль Обработка ассоциацией бактерий (прототип) Обработка штамм В.21 Средняя длина стебля, см Средняя длина корня,см 3,40,1 2,10,2 3,80,2 2,70,1 4,70,2 Таблица 2 Нитрогеназная, целлюлазная активность и продуктивность азотфиксации целлюлолитических бактерий В.21 Нитрогеназная активность,мкмольС 2 Н 4/мл/ч 3,870,01 Синтез витаминов группы В целлюлолитическими бактериями В.21 Витамины Тиамин (1) Пантотеновая кислота (В 3) Никотиновая кислота (Рр) Таблица 4 Накопление свободных аминокислот целлюлолитическими бактериями В.21 на среде с различными источниками углерода, мг/1000 мл Аминокислоты Аспарагиновая кислота Треонин Сери Глутаминовая кислота Глицин Аланин Валин Изолейцин Лейцин Тирозин 4 Источники углерода Пшеничная солома Источники углерода Пшеничная солома Таблица 5 Спектр антагонистической активности штамма В.21 в отношении фитопатогенных грибов Зоны подавления роста тест-культур, мм Влияние обработки семян штаммом В.21 на их всхожесть, пораженность проростков и урожайность донника Варианты опыта ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм целлюлолитических бактерий 21, депонированный в Институте микробиологии и вирусологии МОН РК, под номером ИмиВ В-52, используемый для получения бактериального удобрения под донник.