Способ получения средства, обладающего общеукрепляющим и протективным эффектом

(51) 61 39/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ протективным эффектом, в частности представляют собой протелитические фрагментыв стабильной (нереверсивной) форме -3,обработанной инфразвуком и может быть использован в качестве протектора во вредных производствах и экологически неблагоприятных регионах. Результат достигается тем, что штамм бактериив -3 форме засевают на питательную среду содержащую 1-2 агар-агара и 2 глюкозы и ставят в термостат при 37 С в течение 2-3 часов, смывают с питательной среды физиологическим раствором. Полученный раствор подвергается инфразвуковому воздействию (17,7 Гц) на расстоянии 10 см в течение 20 минут. Оставляют при комнатной температуре на 2-3 суток.(72) Намазбаева Зулькия Игеновна Резников Борис Федорович Бенц Татьяна Владимировна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Национальный центр гигиены труда и профессиональных заболеваний Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56) Резников Б.Ф. Гипотеза старения бактерий и эукореотических клеток// Научные основы животноводства и кормопроизводства Сб.ст.Усть-Каменогорск, 1984. - с. 100-130 Изобретение относится к медицине и касается способа получения средства для укрепления иммунитета и его защиты (протективное действие) у лиц длительно подвергающихся воздействиям токсичных соединений,обладающих иммунодепрессивным эффектом(вредные производства,проживание в экологически неблагополучных районах, частое употребление лекарственных средств). Известен иммуномодулятор Ликопид. Ликопид является синтетическим аналогом биологически активного фрагмента клеточной стенки всех известных бактерий глюкозаминилмурамилдипептид(ГМДП). Основным механизмом является противоинфекционная защита. При воздействии токсичных соединений не всегда имеет место развитие инфекции. Вместе с тем препарат Ликопид проявляет высокую чувствительность к токсичности химических веществ, теряя свои иммуногенные свойства. В связи с чем применение Ликопида в условиях вредного производства в качестве иммунопрофилактического средства не представляется возможным (Дуева А.А. Значение иммунопротекторов в комплексной терапии профессиональных заболеваний бронхолегочной системы // Медицина труда и промышленная экология. - 2002. -2. - с.37-43). Наиболее близким по существу является способ получения общеукрепляющего средства, которое содержит авирулентные бактерии штамма(нереверсивной) -3 форме и физиологический раствор (Резников Б.Ф. Гипотеза старения бактерий и эукореотических клеток // Научные основы животноводства и кормопроизводства Сб. ст. Усть-Каменогорск, 1984. - с.100-130). Способ получения общеукрепляющего средства осуществляется путем использования штамма бактерийштамма 122, 3 форме засевали на питательную среду,содержащую 1-2 агар-агар и 2 глюкозы ставили в термостат при 37 С, в течении 2-3 часов. На агаре образуются большие прозрачные колонии, которых смывали физиологическим раствором. Средство описанное данным способом направлено на формирование противоопухолевого иммунитета как общеукрепляющее средство, тогда как при действии токсичных соединений химической природы данное средство обладает слабой иммуногенностью при сохранении специфических свойств. Недостатком способа является то, что средство не обладает протективным действием. Известно что,химические соединения оказывают системную неспецифическую иммунотоксичность нарушающую синтез нормальных антител, поражая клеточное и гуморальное звено иммунитета. Описанное средство не предназначено для снятия интоксикации вызванной токсичными соединениями и отличается тем, что обладает в основном противоопухолевым действием как общеукрепляющее средство, что приводит к его ограниченной области применения. Таким образом,все известные общеукрепляющие и иммуномодулирующие средства имеют ограниченную область применения. В основу изобретения поставлена задача разработать способ получения общеукрепляющего и протективного средства, способного вырабатывать нормальные антитела при длительном воздействии токсичных соединений и полностью восстанавливать функционирование иммунной системы (во вредных производственных условиях, в экологически неблагополучных районах). Общеукрепляющий и протективный результат,достигаемый изобретением значительное расширение функциональных возможностей средства способного восстанавливать выработку антител и снимать интоксикацию при воздействии токсичных веществ,обладающим иммунодепрессивным эффектом, а также создание специализированного профилактического протектора рассчитанного на поддержание иммунитета и способного обеспечить химическую защиту организма во вредных производственных и экологических условиях. Поставленная задача решается путем посева бактерийна питательную среду, содержащий 1-2 агар-агара и 2 глюкозы. На агаре образуются большие прозрачно-беловатые колонии, которые смывали физиологическим раствором, кипятили в течении 10 минут,центрифугировали 20 минут при 1500 об/мин,надосадочную жидкость смывали в другую пробирку обрабатывали инфразвуком в диапазоне 17,7 Гц, в течении 20 минут. В результате получали цитоплазматические фрагменты мембран клеток, с устойчивыми антигенными свойствами. Фрагменты цитоплазматической мембраны являются антигенами, на которые в организме образуются только нормальные антитела т.к. бактерии в-3 форме лишены дифференцированных оболочечных антигенов, что позволяет избежать аутоиммунную патологию, но повышает неспецифическую резистентность организма. При воздействии инфразвука в диапазоне (17,7 Гц) в течение 60 минут образуется дополнительная энергия для протелитических фрагментов за счет ионизации раствора. Инфразвуковое воздействие способствует преобразованию АТФ в более концентрированную форму химической энергии, благодаря которому достигается дезинтоксикационный эффект во внеклеточной жидкости за счет улучшения функции печени, выделительной способности почек, санации капиллярной системы. Раствор, обработанный ИФС-1, приобретает нейтральный Рн и за счет физикохимических свойств восстанавливает биоинформационную структуру различных систем организма,в том числе иммунную,детоксикационную проникая в состав внутриклеточных и внеклеточных жидкостей на уровне энергоинформационных сигналов виде неспецифических сигналов оздоравливая иммунную входили комплекс металлов в концентрации от 10-3 до 105 следующие элементы . . . . . Соотношение доз металлов в составе пыли соответствовало среднему соотношению их содержания в атмосферном воздухе промышленного города. Третья группа получала только протективное средство в дозе 1 мл подкожно. Четвертая группа получала пыль с комплексом металлов в течение 10 дней, т.е. вызывалась подострая (хроническая интоксикация) и на этом фоне вводился протектор в дозе 1 мл подкожно. Обследования всех животных проводили по иммунологическим тестам 1-го уровня с определением Т-лимфоцитов(ТФЧ) и теофилинустойчивых (ТФУ) лимфоцитов по иммунограмме (Лебедов К.А. 1990 г). Определяли количество нормальных антител серологическим методом (по методу Резникова Б.Ф. 2006 г.) О степени эндогенной интоксикации судили по массе средних молекул (МСМ) по методу Ковалевского А.И., Нифантьева О.Е. 1989 г., а также по активности ПОЛ по методу Коробейниковой Э.Н.,1989 г., и каталазы (Королюк М.А. 1988 г). Содержание церулоплазмина определяли согласно Ревина Б.М. (1988 г). Использовали общепринятые лабораторные и токсикологические тесты(таблица 1). Таблица 1 Показатели системы иммунитета и факторов неспецифической защиты систему. Такой иммунитет позволит избежать развитие патологии аутоиммунного типа и повышает неспецифическую резистентность организма, что важно для сохранения здоровья трудоспособного населения работающих во вредных условиях, а также для населения проживающих в экологически неблагополучных районах. Положительный эффект от использования предлагаемого общеукрепляющего и протективного средства по сравнению с ближайшим аналогом,достигается за счет того, что происходит выработка нормальных антител устойчивых в условиях вредного воздействия (вредное производство,экологически неблагополучные районы). Введение раствора подкожно в дозе 1 мл вызывает выработку нормальных антител, что сопровождается резким улучшением работы внутренних органов. Быстрее происходит восстановительные процессы при химической интоксикации, исчезают воспалительные процессы,нормализуется метаболизм клеток. Пример 1. Опыты были выполнены на 40 белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 гр. Животные были разделены на группы. Первой группе (10 крыс) внутрибрюшинно вводили 1 мл физиологического раствора. Вторая группа получала внутрибрюшинно в течении 10 дней по 1 мл раствора пыли ( готовили маточный раствор, где 1 мг пыли растворяли в 20 мл физиологического раствора в состав которого Контроль ТМ в составе пыли Протектор ПротекторТМ в(физиологический (2 группа) пыли. раствор) Лейкоциты 17,050,28 9,110,54 18,510,46 14,090,47 Лимфоциты, 109 12,790,48 5,910,32 11,820,29 13,370,48 Моноциты, 1090 0,3320,013 0,2890,011 0,250,009 0,3770,009 Эозинофилы 0,1940,006 0,0750,004 0,1050,007 0,290,009 Т-лимфоциты 3,0140,26 1,6860,054 4,2080,23 2,4020,10 ТФУ-лимфоциты 2,6430,037 1,4770,02 2,7020,001 1,9870,026 ТФЧ-лимфоциты 0,310,009 0,120,02 0,3450,016 0,3520,009 Т тфу / Т тфч 8,350,3 16,20,16 6,730,7 4,10,63 В-лимфоциты, 109 0,7040,009 0,4970,019 0,9420,34 1,7441,08 Норм. анти-тела 1/400,32 1/100,045 1/400,03 1/400,08 При введении внутрибрюшинно пыли в дозе 1 мл лимфоцитов, эозинофилов, Т-лимфоцитов. Вместе с в течение 10 дней вызывал у подопытных животных тем наблюдается значительное снижение отношения развитие подострой интоксикации проявляющейся Ттфу/Ттфч и повышение выработки нормальных статистически значимыми изменениями со стороны антител до контрольных величин 1/40. лейкоцитов, лимфоцитов неспецифической защиты Полученные результаты показывают, что клеточного звена эозинофилов, соотношение введение комплекса металлов в составе пыли лимфоцитов. Наблюдалось значительное приводит к иммунодефициту, проявляющейся возрастание соотношения Ттфу/Ттфч, тенденция к системной неспецифической иммунологической снижению гуморального звена иммунитета (В- недостаточностью, тогда как при введении лимфоцитов). Снижение выработки антител до 1/10 протектора происходит ослабление токсического при норме 140- 180. действия металлов. При введении протекторакомплекс токсичных Полученные результаты позволяют признать металлов в составе пыли по сравнению со 2 группой иммунокоррегирующий эффект протектора. По(введение только металлов в составе пыли) видимому, протектор оказывает как прямое, так и выявлено значительное увеличение лейкоцитов, но в опосредованное действие. Прямое действие пределах контрольных величин. Такая оказывают согласно литературным данным за счет направленность характерна для клеточной реакции фрагментов цитоплазматических мембран 3 бактериальных клеток, усиливающий образование нормальных антител. Опосредованное воздействие связано с активацией антиоксидантной системы, в частности высокой активности на клеточном уровне- каталазы, а на уровне организма высокое содержание церулоплазмина, которые ограничивают цитотоксическое действие комплекса металлов. Возможно протектор способен выступать в роли ловушек свободных радикалов. Пример 2. Эксперимент на белых крысах самках весом 160-170 гр. Вводили внутрибрюшинно комплекс металлов в составе пыли в дозе 1 мл (ведущих по концентрации) металлов свинца и кадмия свинец 410-3, кадмия -10-3, остальные металлы 10-8,С - 1010-6,10-5, С-10-7, М 10-7. На фоне хронического действия пыли, т.е. по 1 мл в течение 10 дней вызывали субхроническую интоксикацию тестируемого по биохимическим показателям по Алат, Асат, общему белку,соотношением альбумин/глобулин(оценка белоксинтезирующей фракции) печени. Затем вводили 1 мл подкожно протектор. Метаболические изменения в конце эксперимента приведены в таблице 2. Содержание свинца и кадмия в моче определяли на атомноабсорбционном спектрофотометре МГА-915. Таблица 2 Биохимические показатели при воздействии токсичных соединений Показатели Контроль ТМ в пыли Протектор ПротекторТМ в(2 группа) составе пыли раствор) Асат мкМ/мл ч 2,080,3 13,80,36 2,20,22 2,60,71 Алат мкМ/мл ч 2,90,5 8,30,79 2,40,8 2,70,39 МДА нмоль/мл 2,00,11 7,30,18 2,90,12 3,00,20 Альбумины/ глобулины 0,70,02 0,40,05 0,740,05 0,90,01 Каталаза Церулоплазмин МСМ ус.ед. 0,70,005 0,91 0,08 0,080,2 0,170,09 Общий белок 76,02,1 64,2 3,1 71,03,8 70,24,2 Свинец мкг/л 17,12,1 59,63,9 20,23,4 67,84,0 Кадмий мкг/л 1,30,19 3,72,1 3,82,8 6,03,5 Результаты исследования показали,что достоверно контрольный уровень. Введение субхроническая интоксикация вызывает нарушения подкожно раствора протектора в дозе 1 мл белоксинтезирующей функции(снижения приводило к ослаблению ряда нарушений со содержания общего белка,альбуминов и стороны печени, почек, повышении экскреции соотношения Альбумин/глобулины) и металлов с мочой, что свидетельствует об ферментопатию (Асат, Алат) со стороны печени. О улучшении функции почек за счет повышенной поражении почек свидетельствовали повышение элиминации металлов, тем самым защищающих от коэффициентов массы правой и левой почки, токсического повреждения и имеет положительное повышение концентрации белка в моче. Суточная значение для организма в целом (таблица 3). экскреция свинца и кадмия в моче превышало Таблица 3 Показатели массы внутренних органов Показатели Масса тела после затравки Масса почек на 100 г массы тела Левая Правая Креатинин в моче мкМ/сут Белок в моче мкгл Креатинин в сыв.кр. мкМ/л Диурез мл/сутки Выводы 1. Средство обладает общеукрепляющим и протективным свойством за счет повышения клеточного и гуморального звена иммунитета и активации антиоксидантной системы. 2. Протективное действие проявляется усиленным выведением металлов (свинца и кадмия) и нормализацией белоксинтезирующей функцией печени, т.е. дезинтоксикационной функции. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения средства, обладающего общеукрепляющим и протективным эффектом,содержащего авирулентные бактерии штаммав стабильной -3 форме, которые засевают на питательную среду,содержащую 1-2 агар-агар и 2 глюкозы и ставят в термостат при 37 С, в течение 2-3 часов, затем смывают физиологическим раствором,отличающийся тем,что дополнительно физиологический раствор обрабатывают ультразвуком в диапазоне 17,7 Гц в течении 20 минут.