Штамм вируса гриппа Н5N3 А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09, используемый для приготовления диагностических препаратов

(51) 61 39/145 (2010.01) 12 7/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ приготовления на его основе диагностических тестсистем пригодных для идентификации и изучения антигенной структуры гемагглютинина вновь выделенных изолятов вирусов гриппа А. По структуре гемагглютинина отличие штамма вируса гриппа А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 (53) от эталонного варианта А/крачка/Ю. Африка/1/72 (53) превышает 10. Изолят обладает гемагглютинирующей (1512) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 1640), характеризуется термостабильным гемагглютинином, поскольку сохранял способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 240 мин.,репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 7,50 ЭИД 50/0,2 мл. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов РГП НИИ проблем биологической безопасности КН МОН РК за номером депозита М-09-10/Д. Предлагаемый вариант активно агглютинирует эритроциты кур,морской свинки, мыши, кошки, козы, барана,лошади и крупного рогатого скота. Штамм вируса гриппа А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 (53) может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для идентификации вновь выделенных изолятов вируса гриппа А птиц и обнаружения специфических антител в сыворотках крови.(72) Жуматов Кайнар Хамзаевич Ишмухаметова Наиля Галивеевна Асанова Сауле Естаевна Карамендин Кобей Омертаевич Кыдырманов Айдын Исагалиевич Даулбаева Клара Дакишевна Саятов Марат Хусаинович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА Н 53 А/БЕЛОЛОБЫЙ ГУСЬ/ЦЕНТРАЛЬНЫЙ КАЗАХСТАН/3733/09, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения диагностических препаратов к вирусу гриппа А подтипа 53,а также проведения фундаментальных молекулярно-биологических исследований. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 с целью Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для научных целей и получения специфических тест-систем для диагностики высокопатогенной гриппозной инфекции диких и домашних птиц. Вирусы гриппа принадлежат к семейству, включающему 5 родов вирусы гриппа А, В, С,и . К настоящему времени известны 16 разновидностей гемагглютинина (НА) и 9 нейраминидазы , на основе которых классифицируются различные антигенные подтипы вируса гриппа. .,1992, . ., 2005. Вирусы гриппа А изолированы от широкого круга хозяев,включая более 100 видов птиц, из млекопитающих к нему восприимчивы человек и домашние животные(свиньи, лошади, кошки), а также грызуны, норки,тигры, тюлени, китообразныеВ.., 2006. Известен референсный вариант вируса гриппа А/крачка/Ю. Африка/1/72 (53), изолированный во время крупной эпизоотии среди диких пернатых 1, 2. В 1976 г. во время эпизоотии среди чаек и крачек в Астраханской области 3 изолированы вирусы гриппа 51, 52 и 53. В 2005 г. высокопатогенные штаммы вируса гриппа 51 получили распространение в России(Новосибирская область, с. Суздалька), явившись причиной эпизоотии среди диких и домашних птиц 4.На территории Казахстана в августе 2005 г. из органов погибших диких уток и домашних гусей,доставленных из Павлодарской области в НИИПББ(п.г.т. Гвардейский), были выделены штаммы ВПВГ 51 5. В 2006 г. поступили сообщения о выделении высокопатогенных штаммов 51 у диких водоплавающих птиц на территории Азербайджана и Украины. В 2006 г. на побережье Восточного Каспия, от погибшего лебедя-шипуна выделен высокопатогенный штамм вируса гриппа птиц 51, с интравенозным индексом иатогенности для 6-недельных цыплят равным 1,77. Изоляция вируса гриппа А/лебедь шипун/Актау/1460/06 (51),антигенно родственного с эталоном А/Вьетнам/2004(51) свидетельствует о потенциальной возможности возникновения в РК высокопатогенного для человека эпидемического варианта вируса гриппа. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09(53),позволяющего использовать его в качестве диагностикума с целью выявления специфических антител в сыворотках крови при вакцинальном и естественном инфицировании птиц современными вариантами вируса гриппа А подтипа 53, а также для проведения фундаментальных молекулярнобиологических исследований. Технический результат обеспечивается изоляцией оригинального казахстанского варианта вируса гриппа(53) отличного от эталонных и ранее выделенных штаммов, и обладающим уникальными антигенными и биологическими характеристиками. 2 Новый штамм депонирован и хранится в коллекции микроорганизмов РГП НИИ проблем биологической безопасности КН МОН РК (депозит М-09-10/Д). Антигенная структура. Выделенный штамм идентифицировали в реакциях торможения гемагглютинации(РТГА) и подавления нейраминидазной активности с использованием набора референс-сывороток к вирусам гриппа с подтипами НА - 6 и 1-9 (табл. 1, 2). Результаты, представленные в таблицах 1 и 2,показывают,что штамм А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 имеет антигенную формулу 53. Генетическая характеристика вируса А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 дана с помощью секвенирования нуклеотидной последовательности гена НА. Результаты сравнительного анализа 799 нуклеотидов гена НА вируса А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 (53) с штаммами из ,представленные на рисунке, показывают, что казахстанский изолят отличается от эталонного варианта А/крачка/Ю. Африка/1/72 (53). Штамм А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09(53) по гену НА оказался филогенетически близким с более ранними западноевропейскими штаммами(52),///7/2002 (52) и образует вместе с ними отдельный кластер. Адаптационные свойства Штамм А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09(53) активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37) температуре до инфекционного титра 7,50 ЭИД 50/0,2 мл. Штамм характеризуется высокой гемагглютинирующей(1512) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 1640). Свойства агглютинации. Исследуемый штамм активно агглютинирует эритроциты кур, морской свинки, мыши, кошки, козы, барана, лошади и крупного рогатого скота. Терморезистентность. Предлагаемый штамм обладает термостабильным НА, поскольку сохранял способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 в течение 240 мин. Ингибиторочувствительность. Штамм А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09(53) оказался резистентным к неспецифическим ингибиторам нативных и прогретых (62 - 30 мин, 100 - 10 мин) сывороток морской свинки и кролика. Элюирующая активность. По скорости элюции с нативных куриных эритроцитов исследуемый штамм относится к умеренно элюирующему варианту, так как полностью элюировал через 150 мин инкубации при 37. Патогенность. Установлено, что штаммы ВПГП/Н 5, обладают в сайте протеолитического нарезания НА дополнительными вставками положительно заряженных аминокислот, таких как аргинин , лизин (К) и характеризуются последовательностью - -. Изолят А/белолобый гусь /Центральный Казахстан/3733/09(53) отличались от изолятов А/лебедь шипун/ Актау/1460/06(51) А/огарь/10 жный Казахстан/кг-0783/07 (52) наличием одной дополнительной вставки аргинина в сайте расщепления НА(табл. 3). Таким образом, штамм А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 (53) по сайту расщепления отнесен к апатогенному варианту вируса гриппа А. К выделенному штамму А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09(53) получена кроличья иммунная сыворотка. Схема иммунизации. Для иммунизации используют кроликов породы шиншила массой 2,5-3 кг. Первую иммунизацию проводят подкожно в область шейных и подключичных лимфатических узлов путем 15-20 точечных инъекций концентрированного антигена (100 мкг) в смеси с полным адьювантом Фрейнда ( , ). Через 3 недели животных иммунизируют подкожно(с адьювантом) и внутривенно (без адьюванта) равным количеством антигена. Кровь у животных берут из краевой вены уха через 7 дней после повторной иммунизации. Титр иммунной сыворотки заявляемого штамма в РТГА с гомологичным антигеном составляет 1640. Выявленные свойства указывают на то, что вирус А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 (53) отличается от эталонного штамма вируса гриппа А подтипа 53 и является новым природным, эпизоотическим вариантом вируса гриппа(53). Приготовленные на его основе диагностические препараты могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпидемических и эпизоотических вспышек гриппа, а также для оценки напряженности популяционного иммунитета. Таблица 1 Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолята вируса гриппа А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 Иммунная сыворотка к референсному Гомологичный Титр антител к изоляту А/белолобый штамму титр гусь/Центральный Казахстан/3733/09 А/крачка/Ю. Африка/1/62 (53) 2560 2560 А/утка/Гонконг/205/77 (52) 320 160 Примечания - даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов. С иммунными сыворотками к вирусам гриппа с подтипами гемагглютинина- Н 4, Н 6-Н 16 получены отрицательные результаты Таблица 2 Идентификация подтипа нейраминидазы казахстанского изолята вируса гриппа А/белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09 Изолят гусь/Центральный Казахстан/3733/09 Примечания -- реакция отрицательная- представлена обратная величина титра ингибирования нейраминидазой активности. С диагностическими сыворотками к нейраминидазам вируса гриппа 1-24-9 получены отрицательные результаты. Таблица 3 Сравнительная характеристика сайта протеолитического расщепления НА казахстанских изолятов вируса гриппа А/Н 5 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа А /белолобый гусь/Центральный Казахстан/3733/09,рода А,депонированный в коллекции микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Национального 3 центра по биотехнологии КН МОН РК за номером М-09-10/Д, используемый для приготовления