Способ выявления эндогенных стадий эймерий в гистологических срезах кишечника

(51) 61 33/10 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ предметном стекле по 5-7 штук. Удаляют парафин,выдерживая в двух порциях ксилола по 3 минуты,осторожно удаляют остатки ксилола по краям срезов фильтровальной бумагой, высушивают на воздухе 10 минут. С помощью светового микроскопа предварительно определяют местоположение эндогенных стадий эймерий,которые просматриваются на краях ворсинок эпителия кишечника в виде линз округлой формы,отмечают примерное направление в сторону исследуемого участка липкой углеродной лентой в форме клина, зарисовывают на листе бумаги примерные контуры участка исследования и метку. Далее,помещают объект исследования в сканирующий электронный микроскоп, выставляют параметры для сканирования давление 1-40 Ра,напряжение 5-10 , под малым увеличением находят предварительно отмеченный участок(участки) и получают электроносканограммы, при увеличениях от х 1000-х 5000 и более. При этом определяют рельеф изучаемого объекта и устанавливают размеры эндогенных стадий эймерий, их форму и локализацию, с учетом выявленных дефектов, возникающих при резании микротомным ножом.(72) Дербышев Камиль Юрьевич Какимов Айтбек Калиевич Ибрагимов Надир Кадырович Сейлгазина Сауле Мункановна Ануарбекова Аймара Серикбековна Дербышева Альфия Газизяновна(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ СТАДИЙ ЭЙМЕРИЙ В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ КИШЕЧНИКА(57) Изобретение относится к ветеринарии и касается способов выявления эндогенных стадий эймерий в эпителии кишечника и может быть применено при диагностике эймериозов у птиц. Техническим результатом изобретения является быстрота, простота, наглядность и достоверность выявления эндогенных стадий эймерий в эпителии кишечника. Предлагаемый способ заключается в следующем. Из зафиксированных в нейтральном формалине и залитых в парафин органов на санном микротоме получают серийные срезы толщиной 10 мкм на 24234 Изобретение относится к ветеринарии и касается способов выявления эндогенных стадий эймерий в эпителии кишечника и может быть применено при диагностике эймериозов у птиц. Известен способ выявления эндогенных стадий размножения эймерий в эпителии кишечника с использованием реактива Шиффа (ШИК-реакция) по В.А. Шубину и А.А. Ибрагимову. Патологоанатомическая диагностика болезней птиц/А.В. Акулов, В.М. Апатенко, Б.Ф. Бессарабов и др. Под ред. В.П. Шишкова и др., М., Колос, 1978,с.228. Недостатком данного способа является то, что реактив Шиффа достаточно трудно готовить, не всегда получается требуемое качество, малый срок годности реактивов Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. Медицина, Л.,1969, с.267-268. Известен общепринятый способ изучения гистологического строения тканей Практикум по патологоческой анатомии сельскохозяйственных животных /А.В. Жаров, И.В. Иванов, А.А. Кунаков и др. Под ред. В.П. Шишкова, А.В. Жарова. - М. Агропромиздат, 1989, с.8-14. По известному способу для проведения исследования эпителия кишечника кусочки кишечника, взятые из свежего патологического материала, фиксируют в нейтральном формалине,заливают в парафин, изготавливают срезы на микротоме толщиной около 10 мкм, окрашивают обычными гистологическими красителями(гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону), и изучают. При определении эндогенных стадий эймерий в эпителии кишечника, обращают внимание на форму паразитов, их размеры и локализацию. Недостатком известных способов гистологического исследования является необходимость окрашивать гистологические срезы после депарафинирования, при этом расходуются реактивы, а процесс окраски длителен (около 1 часа). Кроме того, на полученных окрашенных гистологических срезах (гематоксилин-эозином или по Ван-Гизону) размеры эндогенных стадии эймерий трудно определить, так как нож микротома при резании гистологических срезов не проходит точно в определенной плоскости изучаемых паразитов, а иссекает их в разных участках, поэтому паразиты в эпителии кишечника кажутся, слишком различными по размеру. При этом увеличение при световой микроскопии не позволяет подробней изучить эндогенные стадии эймерий в эпителии кишечника. Наиболее близким по технической сущности и,взятым за прототип,является способ гистологического определения и изучения эндогенных стадий эймерий в эпителии кишечника с окраской Болезни птиц. Составитель книги доцент Ф.М. Орлов. Изд. 2-е перераб. и доп. - М.,Колос, 1971, с.234 технические особенности этапов подготовки подробно описаны в литературе Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. Медицина, Л., 1969, с. 14, 15, 37, 40, 52-53,55, 163. 2 По данному способу для исследования кусочки кишечника фиксируют в нейтральном формалине и заливают в парафин. Гистологические срезы из парафиновых блоков получают на санном микротоме толщиной 10 мкм,закрепляют на предметном стекле, окрашивают гематоксилин-эозином, заключают в бальзам и накрывают покровным стеклом. Полученные гистологические препараты исследуют с использованием оптического микроскопа при увеличениях 00-х 1500. Описывают форму,строение, изучаемых объектов их локализацию,размеры. При этом эндогенные стадии эймерий выглядят округлыми образованиями, чуть более темно окрашенными по сравнению с окружающей тканью, размеры их различны, поперечные промеры их могут варьировать и значительно отличаются. Недостатком данного способа является сложность подготовки материала к исследованию,длительность процесса, неточность определения их размеров, формы и локализации. Поставлена задача по разработке достаточно простого,быстрого способа определения эндогенных стадий эймерий в эпителии кишечника,обеспечивающего точность описания паразитов. Техническим результатом изобретения является быстрота, простота, наглядность и достоверность выявления эндогенных стадий эймерий в эпителии кишечника. Для достижения технического результата применили сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) серийных срезов, полученных из парафиновых блоков. Непосредственно перед исследованием с использованием СЭМ с подготовленных срезов удаляют парафин ксилолом. Депарафинированные срезы просматривают в световой микроскоп под увеличением х 200-х 400,для предварительного установления местоположения эндогенных стадий эймерий. Крайние кишечные клетки зараженные эндогенными стадиями при просмотре выглядят округлыми образованиями, похожими на линзы. Такие предполагаемые места поражения кишечных клеток отмечают приклеиванием на стекло указателя - кусочков углеродной липкой ленты клиновидной формы или другим способом,примерно,отмечая направление к месту тщательного исследования с помощью СЭМ. Зарисовывают на листе бумаги контуры исследуемого участка и приклеенной полоски липкой ленты, для облегчения последующего поиска в сканирующем микроскопе исследуемого участка. Подготовленное вышеописанным способом стекло с депарафинированными срезами помещают в сканирующий электронный микроскоп и под малым увеличением, ориентируясь по рисунку и указателю, находят необходимый участок. Затем ставят увеличение х 1500-х 2000 и более по мере необходимости. Делают необходимые снимки для дифференцировки объектов исследования, при этом определяют размеры микро, макрогамонтов и 24234 сформировавшихся ооцист в эпителии кишечника,измеряя действительные поперечные размеры паразитов и их структуры. Точность измерения паразитов достигается благодаря возможности получить достаточно высокое увеличение и определения рельефа, реальной формы исследуемых объектов, возможности определить целые части объектов и разрезанные микротомным ножом. При необходимости можно отснять стереопары,известным способом - два снимка одного и того же участка при некотором наклоне объекта до 10, с сохранением центра изображения. Исследование с использованием сканирующего электронного микроскопа можно проводить, как без напыления объекта исследования, так и с углеродным напылением, напылением золотом,медью и др. Без напыления применяют давление около 1-40 Ра, напряжение 5-10 1, увеличение до х 5000-х 12000. При напылении исследуемого объекта можно получить изображение до х 20000. Изучение депарафинированного среза эпителия кишечника с использованием сканирующего электронного микроскопа позволяет точнее определить размеры паразитов, их форму и локализацию. Предлагаемый способ заключается в следующем. Из зафиксированных в нейтральном формалине и залитых в парафин органов на санном микротоме получают серийные срезы толщиной 10 мкм, на предметном стекле по 5-7 штук. Удаляют парафин,выдерживая в двух порциях ксилола по 3 минуты,осторожно удаляют остатки ксилола по краям срезов фильтровальной бумагой, высушивают на воздухе 10 минут. С помощь светового микроскопа предварительно определяют местоположение эндогенных стадий эймерий,которые просматриваются на краях ворсинок эпителия кишечника, в виде линз округлой формы, отмечают примерное направление в сторону исследуемого участка липкой углеродной лентой в форме клина,зарисовывают на листе бумаги примерные контуры участка исследования и метку. Далее, помещают объект исследования в сканирующий электронный микроскоп,выставляют параметры для сканирования давление 1-40 Ра, напряжение 5-10 под малым увеличением находят предварительно отмеченный участок (участки) и получают электроносканограммы при увеличениях от х 1000 х 5000 и более. При этом определяют рельеф изучаемого объекта и устанавливают размеры эндогенных стадий эймерий, их форму и локализацию с учетом выявленных дефектов,возникающих при резании микротомным ножом. Изобретение иллюстрируется рисунками. Фиг. 1. Участок эпителия кишечника цыпленка пораженный различными эндогенными стадиями эймерий (электроносканограмма, х 1400). Фиг. 2. Микро- и макрогамонты эймерий. Определение размеров в мкм(электроносканограмма, х 4000). Фиг. 3. Изображение участка эпителия ворсинок с эндогенными стадиями эймерий, полученное с помощью оптического микроскопа, (окраска гематоксилин-эозином, увеличение х 400). Фиг. 4. Изображение участка эпителия ворсинок с эндогенными стадиями эймерий, полученное с помощью оптического микроскопа, (окраска гематоксилин-эозином, увеличение х 1500). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выявления эндогенных стадий эймерий в гистологических срезах кишечника,предусматривающий фиксацию исследуемых кусочков кишечника в формалине, заливку в парафин, приготовление серийных гистологических срезов на предметном стекле, депарафинирование гистологических срезов, микроскопирование и описание объекта исследования, отличающийся тем, что после депарафинирования гистологический срез высушивают, осуществляют предварительный просмотр в микроскоп и определяют предполагаемое место дислокации паразитов,отмечают его указателем из липкой углеродной ленты клиновидной формы, зарисовывают контуры пораженных участков на бумаге, просматривают объект с помощью сканирующего электронного микроскопа с параметрами давление 1-40 Ра,напряжение 5-10,под малым увеличением находят предварительно отмеченный участок(участки), затем получают электроносканограммы при увеличениях от х 1000-х 5000 и более.