Способ оценки нарушения обменных процессов при сахарном диабете 2 типа в эксперименте

(51) 01 33/53 (2009.01) 01 В 33/577 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ соматостатина, в- клетках антрального отдела желудка, для чего предварительно осуществляют забор гастробиотата с последующим иммуногистохимическим исследованием экспрессии гормона соматостатина и при содержании гормона соматостатина - 0-2 гранулы в поле зрения нарушения обменных процессов оценивают как компенсированные,при 3-7 как субкомпенсированные, при 8 и более - как некомпенсированные. Предлагаемый способ значительно повышает точность оценки нарушения обменных процессов,снижает себестоимость исследования, увеличивает его доступность,так как позволяет экстраполировать результаты иммуногистохимического исследования гастробиоптата на содержание соматостатина в поджелудочной железе,что избавляет от необходимости проведения чрескожной биопсии поджелудочной железы для оценки степени происходящих в ней обменных нарушений.(72) Идрисов Алишер Саугабаевич Абылайулы Жангентхан Джакупова Айгуль Саруаровна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Научно-исследовательский институт кардиологии и внутренних болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ОБМЕННЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2 ТИПА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням и эндокринологии, и может быть использовано для оценки нарушений обменных процессов при сахарном диабете 2 типа в эксперименте. Способ оценки нарушений обменных процессов при сахарном диабете 2 типа в эксперименте включает определение содержания гранул гормона 23585 Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням и эндокринологии, и может быть использовано для оценки нарушений обменных процессов при сахарном диабете 2 типа в эксперименте. В настоящее время по принципам доказательной медицины, при диагностике сахарного диабета,помимо учета клинических проявлений,необходимым подтверждением болезни является лабораторное обнаружение наличия сахара в крови(глюкозурия). Характерное повышение сахара в крови и моче выявляется при выраженных,клинически оформленных стадиях заболевания, тогда как для выявления скрытых, латенто текущих форм диабета(нарушение толерантности к глюкозе или потенциальное нарушение толерантности) требуется применение специальных сложных и трудоемких лабораторных методик. В связи с тем, что данное заболевание развивается вследствие патологического нарушения обмена веществ,вызванного нарушением секреции инсулина или нарушением механизма действия этого гормона на ткани, не менее важной на современном этапе является оценка степени нарушения обменных процессов при сахарном диабете 2 типа. Поскольку именно от этого зависит как прогноз заболевания,так и тактика последующей медикаментозной терапии. Известен способ оценки нарушения обменных процессов при сахарном диабете 2 типа путем тепловизионной диагностики состояния кровообращения нижних конечностей, который по специфическим изменениям,таким как микроангиопатии и макроангиопатии, позволяет комплексно оценить состояние кровообращения нижних конечностей,выявить изменения периферического кровообращения и на основании этого судить о степени нарушения обменных процессов.(Основы клинической дистальной термодиагностики под рук. Л.Г.Розенфельда.Киев. -Здоровье.- 1988.- с. 92). Недостатками известного способа является то,что для выявления ранних, скрытых форм нарушения обменных процессов по патологии сосудов нижних конечностей у лиц моложе 40 лет необходимо проводить функциональные пробы с общим или локальным охлаждением нижних конечностей. Такая процедура охлаждения нижних конечностей с целью уточняющей диагностики достаточно трудоемка и малопривлекательна для пациента. Кроме того, данный способ не обладает высокой точностью. Известен способ оценки нарушения обменных процессов при сахарном диабете 2 типа,включающий определение в сыворотке крови гликированного гемоглобина (1 ). Данный показатель в значительной степени отражает состояние обменных процессов при СД и позволяет судить о наличии или отсутствии компенсации СД. Так как в эритроциты глюкоза поступает инсулиннезависимо,гликозилирование 2 осахаривание гемоглобина является необратимым процессом, и его степень прямо пропорциональна концентрации глюкозы,с которой он контактировал. При постоянной гипергликемии гликозилированию может подвергнутся до 20 всего гемоглобина.(Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.В. Эндокринология. // М. Медицина.- 2000.- с.455). Недостатками известного способа является то,что иммуноферментный метод определения в сыворотке крови 1 требует дорогостоящего оборудования и специально оснащенного помещения, при этом для одномоментного исследования должно быть подготовлено не меньше 80 проб крови, так как набор рассчитан на 96 проб,анализ нескольких проб крови становится экономически не выгодным, что удлиняет время получения результата. По тем же причинам, данным способом невозможно проводить диагностику в малонаселенных городах и райцентрах. Известен способ оценки нарушений обменных процессов при сахарном диабете 2 типа,включающий определение концентрации гормона соматостатина в крови методом иммунорадиометрического анализа с использование меченных антител. Контринсулярный гормон соматостатин у больных сахарным диабетом 2 является маркером обменных процессов в поджелудочной железе. Чем выше концентрация соматостатина, тем более выражены нарушения обменных процессов.(Балаболкин М.И., Е.М. Клебанова, Креминская В.М. Дифференциальная диагностика и лечение эндокринных заболеваний Руководство. -М Медицина, 2002. -с. 461-501.) Недостатком данного способа диагностики является то, что оценка степени нарушений обменных процессов осуществляется по концентрации гормона в периферической крови. Тогда как его реальное содержание в -клетках поджелудочной железы остается неизвестным. В периферической крови данный гормон быстро распадается на метаболиты и его концентрация непостоянна, кроме того, она зависит от целого ряда различных факторов. Фактически о содержании данного гормона мы судим по косвенному признаку- секреции соматостатина, а не по содержанию в клетке непосредственно его продуцирующей. А также данный способ достаточно дорогостоящий по себестоимости. Наиболее близким к заявляемому является способ оценки нарушения обменных процессов при сахарном диабете 2 типа, включающий определение содержания гранул гормона соматостатина вклетках поджелудочной железы, для чего предварительно проводят пункционную или аспирационную биопсию поджелудочной железы под ультразвуковым контролем.(Тимошин А.Д., Шестаков А.А., Юраев А.В. Малоинвазивные вмешательства в абдоминальной хирургии. ТРИАДА-Х, 2003. - с.68-73.) Недостатком данного способа является его травматичность, возможность развития осложнений(инфицирование,кровотечение,аутолиз поджелудочной железы), необходимость УЗИ контроля. Задача изобретения - разработка способа оценки нарушений обменных процессов при сахарном диабете 2 типа в эксперименте. Технический результат - способ значительно повышает точность оценки нарушения обменных процессов, снижает себестоимость исследования,увеличивает его доступность, избавляет от необходимости проведения чрескожной биопсии поджелудочной железы для оценки степени происходящих в ней обменных нарушений Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки нарушений обменных процессов при сахарном диабете 2 типа,включающем определение содержания гранул гормона соматостатина,отличительной особенностью, согласно изобретению является то,что в эксперименте содержание гранул гормона соматостатина определяют в- клетках антрального отдела желудка,для чего предварительно осуществляют забор гастробиотата с последующим иммуногистохимическим исследованием экспрессии гормона соматостатина и при содержании гормона соматостатина - 0 - 2 гранулы в поле зрения нарушения обменных процессов оценивают как компенсированные, при 37 - как субкомпенсированные, при 8 и более - как декомпенсированные. Возможность оценки нарушений обменных процессов при сахарном диабете 2 типа по содержанию соматостатина в- клетках антрального отдела желудка обусловлено тем, что данные клетки аналогичны- клеткам поджелудочной железы и в них происходит идентичный процесс синтеза гормона соматостатина.- клетки постоянный компонент антрального отдела желудка, они являются составной частью единой диффузнонейроэндокриной системы. Фактически путем экспериментального исследования мы доказали, что имеем дело с одними и теми же клетками, как в желудке, так и в поджелудочной железе. При сахарном диабете 2 типа в этих клетках наблюдается аналогичная картина изменений, что в свою очередь позволяет оценить состояние обменных процессов в поджелудочной железе. Способ осуществляется следующим образом. Эзофагогастродуоденоскопию выполняют по стандартному протоколу исследования. При выполнении диагностической процедуры берут гастробиоптаты по стандартному протоколу забора биопсии. В лаборатории проводят материал с подготовкой парафиновых блоков и препаратов(стекол),окрашенных для обозного гистологического анализа. Затем из приготовленных парафиновых блоков готовят материал для иммуногистохимической окраски. Иммуногистохимическое исследование экспрессии гормона проводят с использованием моноклональных антител (набор для определения соматостатина стандартного промышленно лабораторного изготовления фирмы,) к соматостатину (1100) с определением и подсчтом количества иммунопозитивных клеток окрашенных гранул в -клетках в 3 полях зрения при увеличении 400 на микроскопефирмы(Германия). При содержания гранул гормона соматостатина 0 до 2 в поле зрения нарушения обменных процессов оценивают как компенсированные, при 37 - как субкомпенсированные, при 8 и более - как декомпенсированные. Эффективность предлагаемого способа подтверждена экспериментальными исследованиями. В эксперименте использовалось 90 лабораторных животных (крысы линии Вистар), массой 250-300 г. Которые были разделены на 3 группы по 30 животных. Экспериментальный диабет вызывали единичной внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина (60 мг/кг веса,). За ходом развития диабета следили по появлению в моче глюкозы и кетоновых тел, по повышению содержания глюкозы в крови, по увеличению потребления воды и диуреза, снижению массы тела. Первой группе с момента развития экспериментального диабета проводили инсулинонотерапию. Второй группе животных лечение диабета не проводили. Третья группа составила контроль. Контроль гликемии и глюкозурии у крыс осуществлялся в динамике постоянно в течение 10 дней лечения диабета и наблюдения нелеченого диабета. Лабораторные животные усыплялись калипсолом, согласно международным этическим требованиям. После декапитации и сбора крови,проводилось вскрытие классическим методом. Из внутренних органов в одних и тех же местах иссекались кусочки ткани(желудок,двенадцатиперстная кишка, поджелудочная железа). Проводилась морфологическая оценка состояния слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта путем классической обзорной окраски гематоксилин эозином. Выполнялось иммуногистохимическое исследование на содержание гранул гормона с использованием моноклональных антител (,) к соматостатину (1100) и к прогормону хромагранину А (титр 150), являющихся неспецифическими маркерами нейроэндокринных клеток,с подсчтом количества гранул(иммунопозитивных клеток) в 3 полях зрения при увеличении 400 на микроскопефирмы(Германия). Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась стандартными методами вариационной статистики расчет средних значений (М), ошибки средних значений , -критерий Стьюдента. Достоверными считались различия при р 0,05. Определение прогормона хромагранина А еще раз подтверждает наличие в исследуемой ткани нейроэндокринных клеток и гормонов в них. Результаты 3 23585 При морфологическом исследовании слизистой оболочки желудка, двенадцациперстной кишки и паренхимы поджелудочной железы лабораторных животных (в эксперименте - крыс) с вызванным стрептозотоциновым диабетом в сравнении с контролем были получены следующие данные,представленные в таблице. Таблица 1 Морфометрические показатели экспрессии гормонов в слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки и в поджелудочной железе лабораторных животных (крыс) Клетка Животные с стрептозотоциновым диабетом на инсулинотерапии (1 группа) 30 8,250,03 Животные с стрептозотоциновым диабетом без лечения (2 группа) 30- клетки в слизистой 11,330,04 желудка- клетки в слизистой 13,50,08 17,60,4 двенадцациперстной кишки- клетки поджелудочной 9,10,03 12,40,06 железы Примечание.- р 0,01 по сравнению с контрольной группой. Из данных таблицы видно,что иммуногистохимические показатели содержания гастроинтестинальных гормонов в нейроэндокринных- клетках двенадцатиперстной кишки были аналогичны содержанию в клетках слизистой желудка. Более высокие цифры показателей в двенадцатиперстной кишке связаны с физиологически большим количеством нейроэндокринных клеток, что подтверждается нашими данными при определении в них хромагранина А - 23,11,01 и соответственно в контроле 24,024,3 у лабораторных животных(крыс). Таким образом, как в желудке, так и в двенадцатиперстной кишке имеются- клетки,секретирующие соматостатин. При анализе содержания гранул соматостатина, клетки слизистой желудка наиболее сопоставимы с- клетками поджелудочной железы,что позволяет экстраполировать результаты иммуногистохимического исследования гастробиоптата на содержание соматостатина в поджелудочной железе. Поскольку причина повышенного содержания соматостатина связана с гипергликемией,наблюдаемой при сахарном диабете, концентрация данного гормона позволяет судить о степени нарушения обменных процессов, происходящих в поджелудочной железе. Содержание соматостатина в -клетках желудка сопоставимо с показателями гликемии у животных с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом,данные результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 Показатели гликемии и содержания соматостатина у лабораторных животных Уровень гликемии Содержание соматостатина (гранул в поле зрения (в п/з Животные на Животные без лечения (2 Контрольная группа (3 инсулинотерапии (1 группа) 30 группа) 30 группа) 30 4,8-6,5 ммоль/л от 0 до 2 в п/з 0 до 2 в п/з 0 до 2 в п/з(0)- Относительное количество животных Для возможности оценки нарушения обменных процессов у лабораторных животных проведен корреляционный анализ между уровнем гликемии и содержанием гранул соматостатина в -клетках желудка. Была выявлена прямая сильная связь между этими показателями (0,72). Выявленная зависимость между содержанием соматостатина в свидетельствует о степени нарушения углеводного обмена и обменных процессов в целом при экспериментальном диабете. Это в свою очередь свидетельствует о возможности использования изучения содержания соматостатина для оценки степени тяжести обменных процессов при диабете. Таким образом,представленный способ позволяет экстраполировать результаты 23585 иммуногистохимического исследования гастробиоптата на содержание соматостатина в поджелудочной железе,и избавляет от необходимости проведения чрескожной биопсии поджелудочной железы для его оценки. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ оценки нарушений обменных процессов при сахарном диабете 2 типа, включающий определение содержания гранул гормона соматостатина, отличающийся тем, что в эксперименте содержание гранул гормона соматостатина определяют в- клетках антрального отдела желудка,для чего предварительно осуществляют забор гастробиоптата с последующим иммуногистохимическим исследованием экспрессии гормона соматостатина и при содержании гормона соматостатина - 0-2 гранулы в поле зрения нарушения обменных процессов оценивают как компенсированные, при 37 - как субкомпенсированные, при 8 и более - как декомпенсированные.