Способ диагностики реактивации вируса Эпштейна – Барр у лиц молодого возраста

(51) 01 33/50 (2009.01) 01 33/577 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ иммунофлюоресценции,к вирусному капсидному и раннему антителам вируса Эпштейна- Барр, согласно изобретению, дополнительно определяют,к нуклеарному антителу и при выявлении капсидногодиагностируют очень раннюю первичную инфекцию, при выявлении капсидногои раннегодиагностируют раннюю первичную инфекцию, при выявлении раннегои/или капсидногои наличия у больного повышенной температуры и увеличенных лимфоузлов на протяжении 6 месяцев,диагностируют хроническую инфекцию, при выявлении раннегои нуклеарногодиагностируют раннюю паст - инфекцию, при выявлении капсидного, раннегои нуклеарногодиагностируют реактивацию вируса Эпштейна - Барр, при выявлении капсидногои нуклеарногодиагностируют атипичную реактивацию вируса Эпштейна - Барр.(72) Сембаева Айдана Дауреновна Сатыбалдиева Жаннат Абеновна(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕАКТИВАЦИИ ВИРУСА ЭПШТЕЙНА - БАРР У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА(57) Изобретение относится к области медицины, в частности, медицинской диагностике и может быть использовано при определении реактивации вируса Эпштейна - Барр (ВЭБ). Техническим результатом изобретения является повышение точности,специфичности и достоверности способа. Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики реактивации вируса Эпштейна - Барр у лиц молодого возраста путем определения с помощью иммуноферментного анализа и непрямой 23584 Изобретение относится к области медицины, в частности, медицинской диагностике и может быть использовано при определении реактивации вируса Эпштейна - Барр (ВЭБ). Известен способ диагностики инфекции,вызванной вирусом Эпштейна - Барр путем проведения непрямой иммунопероксидазной реакции с последующим гистохимическим окрашиванием и выявлением антигена вируса Эпштейн-Барр. При выявлении антигена вируса Эпштейн - Барр в виде 5-6 мелких гранул в свободнолежащих лимфоцитах диагностируют легкую форму инфекции,при наличии перинуклеарной экспрессии в агломератах лимфоцитов и 6 - 7 крупных гранул как в агломератах, так и в свободнолежащих лимфоцитах,диагностируют тяжелую форму инфекции, а при наличии перинуклеарной экс-прессии и более 15 гранул в агломератах лимфоцитов рецидивирующее течение инфекции. (Патент РФ 2247390, кл. 01 33/577, опубл. 27.02.2005, Бюл. 6) Недостатком данного способа является его сложность. Известен также способ диагностики вируса Эпштейн - Барр путем определения антители определения с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и непрямой иммунофлюоресценции иммуноглобулинов, ,к вирусному капсидному и раннему антителам. Выявление к вирусному капсидному и раннему антителам подтверждают наличие у больного вируса Эпштейна - Барр. ( .,.,.3. . 1995172(5)1367-70) Недостатком данного способа является то, что по нему невозможно определить реактивацию вируса и тяжесть инфекционного процесса. Задачей изобретения является создание способа диагностики реактивации вируса Эпштейна - Барр у лиц молодого возраста, позволяющего с высокой степенью точности, специфичности и достоверности выявить наличие и определить форму инфекции и соответственно оценить тяжесть процесса для своевременного проведения иммунокорригирующей терапии. Техническим результатом изобретения является повышение точности,специфичности и достоверности способа. Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики реактивации вируса Эпштейна - Барр у лиц молодого возраста путем определения с помощью иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлюоресценции,к вирусному капсидному и раннему антителам вируса Эпштейна- Барр, согласно изобретению, дополнительно определяют,к нуклеарному антителу и при выявлении капсидногодиагностируют очень раннюю первичную инфекцию, при выявлении капсидногои раннегодиагностируют раннюю первичную инфекцию, при выявлении раннегои/или капсидногои наличия у больного повышенной 2 температуры и увеличенных лимфоузлов на протяжении 6 месяцев, диагностируют хроническую инфекцию, при выявлении раннегои нуклеарногодиагностируют раннюю паст инфекцию, при выявлении капсидного,раннегои нуклеарногодиагностируют реактивацию вируса Эпштейна Барр, при выявлении капсидногои нуклеарногодиагностируют атипичную реактивацию вируса Эпштейна - Барр. Способ осуществляется следующим образом. Для определения - (иммуноглобулинов класса М к капсидному белку вируса ЭпштейнаБарр), - (иммуноглобулинов классак ядерному антигену вируса Эпштейна-Барр) и определения - (иммуноглобулинов классак раннему антигену вируса Эпштейна-Барр) используют готовые иммуноферментные тестсистемы ВектоВЭБ, ВектоВЭБ- и ВектоВЭБ ЗАО Вектор-Бест, г. Новосибирск, Россия. В основе определения антител к вирусу лежит твердофазный двухступенчатый непрямой иммуноферментный анализ на планшетах. В лунках планшета иммобилизирован рекомбинантный белок ВЭБ, содержащий фрагмент высокоактивной иммунодоминантной области капсидного белкар 18. В готовом составе набора (в зависимости от того, какой определяют иммуноглобулин) обязательно есть планшет разборный либо с иммобилизованным капсидным антигеном вируса Эпштейна-Барр,либо с иммобилизованным очищенным рекомбинантным белком -1 р-72 вируса Эпштейна-Барр, либо с иммобилизованным очищенным рекомбинантным белком ЕА-138 вируса Эпштейна-Барр,положительный контрольный образец,инактивированный (Кжидкость красного цвета) 1 фл., 1,5 мл., отрицательный контрольный образец,инактивированный(антитела кчеловека или кчеловека). Кровь берут утром из вены строго натощак, с привычными мерами предосторожности. Полученную сыворотку разводят в 10 раз раствором для предварительного разведения сывороток. Для этого вносят в лунки вспомогательного планшета по 90 мкл раствора и добавляют по 10 мкл цельной сыворотки и тщательно перемешивают. Далее готовят раствор для отмывки планшета, в зависимости от количества стрипов, согласно стандартной таблице. Затем готовят раствор для разведения конъюгата (РРК). В чистый флакон вносят соответствующее по числу стрипов количество РРК,добавляют необходимое количество конъюгата и тщательно перемешивают. 70 мкл тетраметилбензидина (ТМБ) вносят в 1 мл субстратного буферного раствора (СБР) в отдельном чистом флаконе перемешивают. В лунку А-1 вносят 100 мкл раствора для разведения сывороток (РРС). Лунка А-1 является контролем поглощения раствора ТМБ. Согласно схеме в лунки стрипа вносят по 100 мкл К-, в другие 23584 по 100 мкл К. В остальные лунки вносят по 90 мкл РРС и по 10 мкл предварительно разведенных исследуемых сывороток. Таким образом,исследуемую сыворотку в лунке разбавляют в 100 раз. Отрезается пленка требуемого размера. Стрип плотно закрывают пленкой. Инкубируют при температуре (37,50,5)С в течение 303 мин. После окончания инкубации осторожно снимают пленку,замачивают в дезинфекционном растворе. Стрип промывают. Жидкость из всех ячеек удаляют полностью в емкость с дезинфицирующим раствором. Затем заполняют все лунки стрипов раствором для отмывки планшета, внося не менее 300 мкл в каждую лунку. Через 30-60 секунд удаляют жидкость и повторяют эту процедуру не менее 4 раз, используя и меняя фильтровальную бумагу. В каждую лунку стрипа, кроме А-1, вносят по 100 мкл раствора конъюгата. В лунку А-1 вносят 100 мкл РРК. Далее отрезают пленку нужного размера, закрывают стрип пленкой плотно. Инкубируют при температуре (37,50,5)С в течение 303 мин. За 5-10 мин до окончания инкубации готовят раствор ТМБ. По окончании инкубации стрип промывают таким же образом, как описано выше. Раствор из лунок тщательно удаляют постукиванием по фильтровальной бумаге. В каждую лунку вносят по 100 мкл раствора ТМБ и инкубируют в темноте в течение 25 минут при 1825 С. Останавливают реакцию добавлением в лунки по 100 мкл стоп-реагента, используя ту же самую последовательность и скорость дозирования, что и для раствора ТМБ. Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность в двухволновом режиме основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - в диапазоне 620650 нм. Допускается регистрация результатов только с фильтром 450 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень осуществляют по воздуху. Измерения проводят не позднее 10-15 мин после остановки реакции. Результаты оценивают по расчетным значениям оптической плотности (ОП). При скрининге на определение иммуноглобулинов класса М к капсидному белку вируса Эпштейна - Барр результат анализа считают положительным,если значение ОП в соответствующей лунке равно или превышает критическое значение (ОПкрит), которое вычисляют по формуле ОПкритОПсрК-0,2. При скрининге на определение иммуноглобулинов классак ядерному антигену вируса Эпштейна - Барр результат анализа считают положительным,если значение ОП в соответствующей лунке равно или превышает критическое значение (ОПкрит), которое вычисляют по формуле ОПкритОПсрК-0,1. Если значение оптической плотности исследуемого образца ОПиссл 0,9 ОПкрит, то результат анализа считают отрицательным. Если ОПиссл попадает в интервал 0,9 ОПкрит-1,4 ОПкрит, то результат анализа сомнительный. Если ОПиссл 1,4 ОПкрит, то результат анализа положительный. При количественной оценке результатов расчет концентрации в у.е./мл анти 1- к вирусу Эпштейна-Барр для положительных сывороток в исследуемом образце (Сиссл) производится по формуле Сиссл ОПиссл ОП ср СК, где ОПиссл - значение поглощения исследуемой сыворотки ОПср К - среднее значение поглощения контрольного образца С- величина концентрации анти 1- контрольного образца в у.емл в данной серии К - коэффициент коррекции, т.к. при значении оптической плотности 1,5 о.е. увеличение ОП в исследуемых образцах не прямо пропорционально увеличению концентрации антител. Меньше 3,5 у.е./мл - сыворотку считать отрицательной. От 3,5 до 5 у.е./мл - сомнительный результат. Присутствие антител точно не подтверждено. Следует исследовать сыворотку крови в более поздний период. Больше 5 у.е./мл - сыворотку считать положительной. При скрининге на определение иммуноглобулинов классак раннему антигену вируса Эпштейна-Барр результат анализа считают положительным,если значение ОП в соответствующей лунке равно или превышает критическое значение (ОПкрит), которое вычисляют по формуле ОПкритОПсрК-0,2. Диагностику реактивации вируса Эпштейна Барр проводят следующим образом- при выявлении только капсидныхдиагностируют очень раннюю первичную инфекцию,- при выявлении капсидныхи раннихдиагностируют раннюю первичную инфекцию,- при выявлении раннихи/или капсидных, наличия у больного повышенной температуры и увеличенных лимфоузлов на протяжении 6 месяцев,диагностируют хроническую инфекцию,- при выявлении раннихи нуклеарныхдиагностируют раннюю паст - инфекцию,- при выявлении только нуклеарных,при отсутствии всех прочих - диагностируют позднюю паст-инфекцию.- при выявлении капсидных, раннихи нуклеарныхдиагностируют реактивацию вируса Эпштейна - Барр,- при выявлении капсидныхи нуклеарныхдиагностируют атипичную реактивацию вируса Эпштейна - Барр. Пример 1. Пациентка К. 18 лет, студентка 1 курса, приехала в Алматы на учебу из небольшого города. На момент осмотра жалобы на чувство слабости, усталости. Из анамнеза - хронических заболеваний нет. За последний год признаки респираторного заболевания отмечались только 1 раз. Точную дату болезни назвать затрудняется. На момент проведения исследования оценивает свое самочувствие как хорошее. Правильного телосложения, обычного питания. Объективный осмотр особой патологии не выявил. Исследование 3 23584 сыворотки крови на антитела к вирусу ЭпштейнаБарр показало наличие только капсидныхв небольшом титре, при отсутствии ранних и нуклеарных . Что само по себе, даже при отсутствии клинических проявлений, позволяет с большой вероятностью предположить очень раннюю первичную ВЭБ-инфекцию. Так как известно, что вирус при внедрении не всегда сопровождается яркой клинической картиной(инфекционный мононуклеоз) и инфекция на данном этапе, у этого пациента может протекать бессимптомно. Проведенное исследование в этой конкретной клинической ситуации позволило дать ряд неспецифических рекомендаций пациенту здоровое питание, закаливающие процедуры, курс поливитаминов, прием препаратов эхинацеи с целью профилактики. Пример 2. Пациентка С., 20 лет, учится в Алматы, родилась в небольшом поселке. Из хронических заболеваний хронический тонзиллит,аллергический ринит, хронический бронхит со школьного возраста. Отмечает также, что болела респираторными заболеваниями (ОРЗ) не менее 6 раз за последний год, и, как правило, эпизод ОРЗ продолжается не менее 7 дней. Последний эпизод ОРЗ около 1 месяца назад. На момент осмотра оценивает свое самочувствие как удовлетворительное. Жалобы на утомляемость,частые головные боли, снижение памяти,потливость, слабость. Объективно правильного телосложения, обычного питания. Подчелюстные и заднешейные лимфатические узлы увеличены до 1 см, подвижные, множественные, мягко эластичной консистенции,в остальных группах не пальпируются. При осмотре зева - гиперемии нет,миндалины увеличены доразмера, рыхлые. По остальным органам и системам патологии не обнаружено. Исследование сыворотки крови на антитела к вирусу Эпштейна-Барр показало наличие капсидныхв небольшом титре и антител к ранним антигенам вируса Эпштейна-Барр, при отсутствии нуклеарных антител. Наличие антител к раннему и капсидному антигенам вируса, наличие жалоб неспецифического характера и данных анамнеза с указанием на частые эпизоды ОРЗ (до 6) позволяют диагностировать раннюю первичную инфекцию. При данном состоянии была показана следующая терапия - разумный режим труда и отдыха, здоровое питание, курс поливитаминов,препараты эхинацеи препараты интерферона и противовирусные препараты не были рекомендованы ввиду отсутствия у пациентки температуры и других острых проявлений инфекции. Было рекомендовано повторить исследование через 2-3 месяца. Пример 3. Пациент П., 18 лет, является жителем Алматы, обучается здесь же. Хронические болезни отрицает. В течение последнего года не болел. На момент осмотра самочувствие оценивает как отличное. Жалоб на момент осмотра нет. Объективный осмотр особой патологии не выявил. Исследование сыворотки крови на антитела к вирусу Эпштейна-Барр показало наличие ранних 4 и нуклеарныхк антигенам вируса. Полученный результат с наибольшей вероятностью позволяет диагностировать раннюю паст-инфекцию,т.е. вирус присутствует в организме и давность внедрения в организм составляет примерно около 6 месяцев, но вирус неактивен на данный период времени и,соответственно,нет никаких клинических проявлений и нет показаний для проведения какой-либо терапии. Пример 4. Пациентка А., 17 лет, является жителем Алматы, обучается здесь же. Хронические болезни отрицает. В течение последнего года не болела. Самочувствие на момент осмотра оценивает как отличное. Жалобы на периодические головные боли. Объективный осмотр особой патологии не выявил. Исследование сыворотки крови на антитела к вирусу Эпштейна-Барр показало наличие нуклеарныхк антигенам вируса. Полученный результат с наибольшей вероятностью позволяет диагностировать позднюю пастинфекцию, т.е. вирус присутствует в организме и имеет место быть нормальный иммунный ответ на вирус, однако ВЭБ неактивен в данный момент и соответственно, нет клинических проявлений и нет показаний для проведения какого-либо лечения. Пример 5. Пациентка Т., 17 лет, приехала в Алматы из районного центра, учится здесь в течение 8 месяцев. Из хронических заболеваний указывает на хронический тонзиллит. Ранее она болела ОРЗ 12 раза в год, здесь за последние 8 месяцев болела 3 раза, каждый эпизод продолжительностью около 7 дней. Свое самочувствие оценивает как удовлетворительное. Жалобы на слабость,потливость, утомляемость. Объективно больная правильного телосложения, несколько пониженного питания. В зеве при осмотре гиперемии нет,миндалины рыхлые, увеличены доразмера. Подчелюстные лимфатические узлы размером до 1 см, мягко эластической консистенции, подвижные, в остальных группах не пальпируются. По остальным органам и системам патологии не обнаружено. Исследование сыворотки крови на антитела к вирусу Эпштейна-Барр показало наличие всех исследуемых антител - капсидных, раннихи нуклеарных. Таким образом,наличие клинических проявлений в виде частых эпизодов ОРЗ, наличия неспецифических жалоб на протяжении нескольких последних месяцев,присутствия в сыворотке крови всех определяемых антител к антигенам ВЭБ позволяет диагностировать реактивацию вируса Эпштейна Барр. При этом состоянии, безусловно показано дообследование - общий клинический анализ крови и т.д. Наблюдение в динамике. В лечебном плане было рекомендовано - разумный режим труда и отдыха, здоровое питание, курс поливитаминов,препараты эхинацеи препараты интерферона(виферон курсом 7 дней). Пример 6. Пациентка Б., 21 года, живет, учится в Алматы. Из хронических заболеваний хронический тонзиллит. Отмечает также,что болела респираторными заболеваниями (ОРЗ) не менее 7 раз за последний год, и, как правило, эпизод ОРЗ 23584 продолжается не менее 7 дней. Последний эпизод ОРЗ около 1 месяца назад. На момент осмотра оценивает свое самочувствие как удовлетворительное. Жалобы на утомляемость,частые головные боли, снижение памяти,потливость, слабость. Объективно правильного телосложения, обычного питания. Подчелюстные и заднешейные лимфатические узлы увеличены до 1 см,подвижные,множественные,мягко эластической консистенции, в остальных группах не пальпируются. При осмотре зева - гиперемии нет,миндалины увеличены доразмера, рыхлые. По остальным органам и системам патологии не обнаружено. Исследование сыворотки крови на антитела к вирусу Эпштейна-Барр показало наличие капсидных ( ) и антител к нуклеарному антигену ( ) вируса Эпштейна-Барр. Наличие антител к нуклеарному и капсидному антигенам вируса, наличие жалоб неспецифического характера и данных анамнеза с указанием на частые эпизоды ОРЗ позволяют диагностировать атипичную реактивацию. При данном состоянии была показана следующая терапия - разумный режим труда и отдыха, здоровое питание, курс поливитаминов,препараты эхинацеи препараты интерферона и противовирусные препараты не были рекомендованы ввиду отсутствия у пациентки температуры и других острых проявлений инфекции. Было рекомендовано повторить исследование через 2-3 месяца. Таким образом, заявляемый способ позволяет определять реактивацию вируса ЭпштейнаБарр,не прибегая к трудоемким методам выделения вируса, типирования и доказательства реактивации инфекции. С помощью этого способа возможно диагностировать различные фазы инфекции,вызванной вирусом Эпштейна - Барр, что может служить основанием для клиницистов в плане тактики проведения специфической и неспецифической терапии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики реактивации вируса Эпштейна-Барр у лиц молодого возраста путем определения с помощью иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлюоресценции,к вирусному капсидному и раннему антителам вируса Энштейна-Барр, отличающийся тем, что дополнительно определяют, к нуклеарному антителу и при выявлении капсидногодиагностируют очень раннюю первичную инфекцию, при выявлении капсидногои раннегодиагностируют раннюю первичную инфекцию, при выявлении раннегои/или капсидногои наличия у больного повышенной температуры и увеличенных лимфоузлов на протяжении 6 месяцев,диагностируют хроническую инфекцию, при выявлении раннегои нуклеарного Тдиагностируют раннюю паст-инфекцию, при выявлении капсидного, раннегои нуклеарногодиагностируют реактивацию вируса Эпштейн-Барр, при выявлении капсидногои нуклеарногодиагностируют атипичную реактивацию вируса Эпштейн-Барр.