Биологическое покрытие для лечения ожогов и ран

(51) 61 35/36 (2006.01) 61 27/42 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Технический результат достигается созданием биологического покрытия для лечения ожогов и ран,состоящего из брюшины крупного рогатого скота животного,которую предварительно обесклеточивают путем промывания в фосфатном буферном растворе содержащем 1 повидон-йод,далее образцы дважды промывают в воде ,содержащей 1 пенициллин/ стрептомицин/амфотерицин и инкубируют в 4 деоксихолате натрия, затем раствор, разбавляя дистиллированной водой, встряхивают в течение 4 ч. при комнатной температуре, после чего образцы инкубируют с ДНК-азой (2000 единиц) в 1 Ми встряхивают на орбитальном шейкере в течение 3 ч. при комнатной температуре. Удаление клеток донора приводит к существенному снижению иммуногенности имплантата,риска местных дегенеративных процессов, запускаемых иммунной системой реципиента.(72) Абугалиев Кабылбек Ризабекович Огай Вячеслав Борисович Данлыбаева Газиза Аятбековна(73) Акционерное общество Национальный научный центр онкологии и трансплантологии(56) Мадыкенов О.М. Местное применение консервированной ксеногенной брюшины при комплексном лечении термических ожогов(54) БИОЛОГИЧЕСКОЕ ПОКРЫТИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОЖОГОВ И РАН(57) Изобретение относится к медицинской биотехнологии, комбустиологии, трансплантологии,может быть использовано для временного закрытия ран различной этиологии. Изобретение относится к медицинской биотехнологии, экспериментальной и клинической медицине, комбустиологии, трансплантологии,может быть использовано для временного закрытия ран различной этиологии. Несмотря на многообразие синтетических раневых покрытий повязки природного происхождения в наибольшей степени соответствуют параметрам идеальной повязки. Золотым стандартом временного покрытия для замещения утраченного кожного покрова является аллогенная кожа амниотическая оболочка. Но в связи с законодательными ограничениями,культурным и религиозным менталитетом,дороговизной аллогенная трансплантация является не всегда доступной. Перспективным направлением является разработка биологических повязок из тканей животных. Особую актуальность данное направление получает в связи с достижениями тканевой инженерии,работами по обесклеточиванию природных тканей с полным удалением клеток и оставлением соединительнотканного каркаса. Использование в качестве биологических покрытий соединительнотканных каркасов (СТК), полученных путем децеллюризации имеет очевидное преимущество перед искусственно созданными покрытиями. В процессе создания идеального тканеинженерного покрытия важным этапом становится необходимость максимально полно удалить клетки исходного донорского материала, но с минимальным нарушением структурной и пространственной целостности соединительнотканного каркаса. Удаление клеток донора, а также частей разрушенных клеточных стенок приводит к существенному снижению иммуногенности имплантата и, следовательно,риска постимплатационного воспаления, некробиоза и других дегенеративных процессов, запускаемых иммунной системой реципиента. СТК это сложная пространственноориентированная система структурных и функциональных белков экстраклеточного матрикса, составляющих основу ткани. Компоненты экстраклеточного матрикса - это в основном коллаген и эластин не имеющие видоспецифичности и идентичны у большинства млекопитающих. В хирургической практике наиболее перспективными средствами лечения ран различной этиологии, ожогов, трофических язв, пролежней являются биологические покрытия на основе природных тканей, которые благодаря своим свойствам оказывают стимулирующее воздействие на ткани раны, создают оптимальную среду для нормального течения процессов регенерации,способствуют элиминации раневого отделяемого и микрофлоры. Известно биологическое раневое покрытие из обесклеточенной ткани животного, в котором в качестве исходного материала используют кожу млекопитающего - свиньи. (Патент РФ 2478403 МПК А 61 27/60 Стерильный аутологичный,аллогенный или ксеногенный имплантат и способ его изготовления /Веселий П., Друнецкий Т.,Стегличек П., Стои В., Матоускова Е. - 2008). Недостатки биологического раневого покрытия на основе свиной кожи - плохая эластичность и расширенные после сушки поры, следствием чего является ослабление бактериального барьера и недостаточная эффективность свойств покрытия, в том числе моделирования на ранах со сложным рельефом. Указанные недостатки ограничивают широкое использование подобных биологических раневых покрытий. Известно биологическое покрытие для лечения термических ожогов из консервированной ксенобрюшины обработанной антисептиком хлорамином.(Мадыкенов О.М. Местное применение консервированной ксеногенной брюшины при комплексном лечении термических ожогов (клинико-экспериментальное исследование) Автореф. докт. мед. наук. - Куйбышев, 1981.-с.38) Недостатками биологического покрытия являются возможные реакции отторжения за счет присутствия клеточных элементов и белков. Кроме того,антисептик хлорамин вызывает воспалительные состояния кожи и раздражение на месте нанесения. Эти покрытия имеют ограниченное применение и недостаточную клиническую эффективность, так как предназначены только для лечения термических ожогов. Задача изобретения - создание клинически эффективного биологического покрытия для лечения гнойно-некротических ран различного генеза и расширение ассортимента средств направленного действия. Разработка доступного, дешвого временного раневого покрытия, обладающего свойствами поддерживать оптимальный микроклимат раны,уменьшить потери через раневую поверхность,предотвращать проникновения микроорганизмов,уменьшить боль, моделироваться на поверхности раны,не обладать местно-раздражающим действием, быть носителем лекарственных веществ,ускорять заживление ожогов и ран, снижать количество осложнений при их лечении. Технический результат достигается созданием биологического покрытия для лечения ожогов и ран,состоящего из брюшины животного, причем используют брюшину крупного рогатого скота(КРС), которую предварительно обесклеточивают детергент-ферментативным способом с оставлением соединительно-тканного каркаса. Преимуществом ксеногенной брюшины является дешевизна,доступность,гигроскопичность,бактерицидность, эластичность, устойчивость к механическому воздействию, биодеградация. Для снижения антигенных свойств, исключения возможных реакций отторжения, повышения срока хранения биологического раневого покрытия проводится обесклеточивание ксеногенной брюшины с оставлением соединительнотканного каркаса. Новизной и явным преимуществом изобретения является применение ксенобрюшины КРС. Брюшина КРС является доступным и дешвым материалом, так как является побочным продуктом при забое животных и не используется для еды или других целей. В отличие от более мелких домашних животных у КРС можно получать большие листы брюшины, что удобно при изготовлении покрытий разных форматов. Нами отработана технология обесклеточивания пластов брюшины 1010, 1015 см, наиболее оптимальные размеры для лечения обширных ожогов и ран. Наиболее оптимальной для использования является париетальная брюшина КРС. Париетальная брюшина снимается большими пластами, поэтому более удобна для производства больших листов биологического раневого покрытия. В тазовой области брюшина более толстая - е можно разволокнить на два листа. На брюшной стенке брюшина имеет более тонкую структуру. Соответственно для обесклеточивания толстой брюшины требуется три цикла обработки детергентферментативным методом, для тонкой достаточно одного цикла обработки детергент-ферментативным методом. В научно-медицинской и патентной литературе подобных биологических раневых покрытий не выявлено. Биологическое раневое покрытие изготавливают следующим образом. Брюшина КРС была получена нами в транспортной среде (-1640 с антибиотиками). Затем брюшину, очищенную от жира и расслоенную, в асептических условиях промывали несколько раз раствором Хэнкса с антибиотиками(по 500 Ед/мл). После чего проводилась обработка брюшины детергент-ферментативным способом. Образцы промывали в фосфатном буферном растворе, содержащем 1 повидон йод. Ткань промывали два раза в дистиллированной воде,содержащей 1 повидон-йод, дважды в воде ,содержащей 1 пенициллин/стрептомицин/амфотерицин,инкубировали в 4 деоксихолате натрия, затем раствор разбавляли дистиллированной водой и непрерывно встряхивали в течение 4 час при комнатной температуре. После двух промываний дистиллированной водой, чтобы удалить остатки клеток, образцы инкубировали с ДНК-азой (2000 единиц) в 1 Ми встряхивали на орбитальном шейкере в течение 3 час при комнатной температуре, чтобы растворить содержимое ядер и деградировать ДНК. Подготовленный коллаген-эластиновый матрикс(КЭМ) представляет собой пласты обесклеточенной ксенобрюшины КРС размером 1010, 1015 см. Образцы после двух промывок дистиллированной водой могут храниться в течение 1 месяца в стерильном фосфатно-буферном растворе,содержащем 1 пенициллин /стрептомицин/ амфотерицин В при 4 С. Микробиологические и морфологические исследования показали, что в течение 30 суток не отмечается изменения структуры коллагеновых волокон и отсутствует рост микрофлоры. Биологическое покрытие в течение 1 месяца может быть использовано без дополнительных способов его стерилизации, не требует отмывания перед пересадкой. Но для продления срока хранения, удобства хранения планируется провести эксперименты по лучевой стерилизации. Изобретение иллюстрируется экспериментальными и клиническими результатами. Экспериментальные исследования. Пример 1. Доклинические опыты проводились на крысах Вистар. Животным в зависимости от применяемого покрытия моделировали различные раны площадью от 5 до 40 общей поверхности тела. Контроль течения раневого процесса проводили на основании оценки изменения площади раневой поверхности. Экспериментальные исследования проводились в двух направлениях. Первое направление - как применение раневого покрытия в сравнении с традиционным методом лечения влияет на выживаемость при обширных ранах. Второе направление - определение сроков регенерации при примененири коллаген-эластиновой матрицы в сравнении с обычным местным методом лечения. Одним из основных требований к раневым покрытиям является барьерная функция минимизировать потери влаги и полезных элементов через раневую поверхность,поддерживать оптимальный для организма микроклимат. При обширных ожогах (ранах) потери через рану, нарушение гомеостаза, инфицирование раневой поверхности приводят к летальному исходу. Для определения влияния на выживаемость применения КЭМ при обширных ранах 10 крысам одинакового пола и размера, после стрижки и сбривание шерсти со спины, наносилась рана площадью 60 см 2. Данная рана является критической из-за больших потерь с поверхности раны, нарушения гомеостаза, нарушения водносолевого баланса, терморегуляции. Так как раны являются критическими, самостоятельно не могут зажить, крысам основной и контрольной групп,после иссечения кожи, проведена мозаичная пересадка собственной кожи. Данная операция была необходимой, давала возможность регенерации обширной раны, уменьшала смертность, так как без аутодермопластики заживление раны была бы невозможно или заняло бы длительное время. Предварительно кожные покровы обрабатывались спиртом 70. Хирургическими ножницами вырезалась кожа на участке размером 106 см. Кровотечения не возникало. 5 крысам основной группы проводилась закрытие раневой поверхности КЭМ с антисептиками. Биологическое раневое покрытие (БРП) фиксировалось на поверхности раны пришиванием и наложением поверх повязки компрессирующей повязки. 5 крысам контрольной группы после иссечения кожи рана закрывалась повязкой с раствором хлоргекседина. Поверх пришивалась компрессирующая марлевая повязка. В послеоперационном периоде крыса помещалась в клетку, укладывалась на стерильную салфетку с целью профилактики аспирации опилок,которыми выстлано дно клетки. Динамическое наблюдение за состоянием животных проводилось в течение всего послеоперационного периода. Оценка выживаемости показала следующее. В основной группе умерла одна крыса. Смерть наступила через 18 часов после моделирования раны. В контрольной группе умерли 3 крысы. В первые сутки умерла 1, на вторые сутки - 1, на четвртые сутки - 1. Таким образом, в основной группе смертность составила 20, в контрольной группе - 60. Причиной гибели крыс были шок, потери жидкости через рану, присоединение инфекции. В основной группе, покрытие из КЭМ, по нашему мнению, уменьшает боль, потери через раневую поверхность, препятствует инфицированию раны. Смерть крысы контрольной группы на 4 сутки объясняем присоединением инфекции и некомпенсированной потерей полезных веществ через раневую поверхность. Первая перевязка проведена на пятые сутки. После анестезии кетамином 5 в дозировке 10 мг внутримышечно сняты марлевые повязки. У крыс контрольной группы ксенотрансплантат плотно прилежит к поверхности раны. Участков размягчения, скопления отделяемого под КЭМ не определяется. Показаний к снятию БРП нет. На поверхность трансплантатов повторно наложена марлевая повязка. В контрольной группе нижний слой умеренно влажный с желтоватым оттенком, плотно пристал к поверхности раны. При попытке снятия повязки имеется болевая реакция, что потребовало дополнительного введения кетамина в дозировке 5 мг. После снятия повязки отмечается приживление кожных мозаичных трансплантатов. Раневая поверхность с налтом фибрина. Имеется вторичное углубление раны в результате высыхания и гибели поверхностно расположенных слов раны с образованием вторичного струпа. Выполнено промывание раны раствором хлоргекседина. Наложены повязки с мазью Левомеколь. Сравнительный анализ динамики заживления ран показал следующее. В основной группе на 15 сутки после моделирования раны, КЭМ плотно прилежит к ране. Признаков нагноения раны нет. Под покрытием определяется разрастание кожных аутотрансплантатов. Имеется концентрическое уменьшение раны. Исходная рана 106 см - 60 см 2. На момент контроля размер раны 74 см, площадь 28 см 2. Уменьшение раны на 32 см 2. На перевязке животных контрольной группы на 15 сутки отмечается образование струпа по краям раны, е углубление. На поверхности раны белесоватый фибриновый налт. Грануляции бледные. Трансплантаты прижили, но краевой эпителизации нет. Отмечается уменьшение раны,размер раны 8.55 см, площадь 42,5 см 2. Также визуально определяются признаки гипотрофии в виде уменьшения размеров, более резкого контурирования линии остистых отростков 4 позвоночника. При измерении массы тела вес крыс основной группы 15015 грамм, вес крыс контрольной группы 12510 грамм. Изучение гистологических срезов раневых образцов с брюшиной, показало, что рана находится на завершающей стадии грануляции ткани, хорошо виден слой плотно-прилегающей брюшины,который обильно инфильтрован клетками с округлыми и веретенообразными ядрами, повидимому,фибробластами. Наличие воспалительных иммунных клеток в ране, как в контрольной группе, обнаружено не было. Однако хорошо видны фибробласты, формирующие дермальный слой кожи и кровеносные капилляры и сосуды, которые необходимы для обмена веществ в заживающей ране. Таким образом, результаты гистологического анализа показали, что процесс заживления раны у животных, которым была наложена брюшина проходит значительно быстрее, чем у контрольных животных. На 40 день после моделирования раны в основной группе у двух крыс раны зажили полностью, у одной имеется рана с тонкой плнкой эпителия. У крыс контрольной группы раны уменьшились в размере, сохраняются раны с гнойным отделяемым. Таким образом,экспериментальные исследования,проведнные на определение выживания и заживления ран, с применением разработанного КЭМ из КБ в сравнении с традиционным лечением показало, что применение раневого покрытия увеличивает выживаемость крыс, ускоряет регенерацию раны, уменьшает вторичные осложнения в виде раневого (ожогового) истощения. Клинические результаты Пример 2. Пациент, 1974 года рождения, история болезни 6119, находилась на стационарном лечение с 27.11.13 по 30.12.2013 года. Диагноз Гигантская трофическая язва левой голени. Интоксикация. Полиорганная субкомпенсированная недостаточность. Лимфедема обеих нижних конечностей. Ожирениестепени. Больна в течение 9 лет, после перенесенного воспаления появилась язва на левой голени. Лечилась стационарно и амбулаторно в различных клиниках Казахстана,Германии. Перенесла операции - аутодермопластики раны левой голени(2005, 2010 г). Язва сохраняется с постепенным увеличение площади и глубины. В последние годы отмечается выраженная клиника эндогенной интоксикации, полиорганной недостаточности. Локально обе нижние конечности отечные за счет мягкого отека (лимфостаз). На левой голени по передне - боковым поверхностям имеется обширная трофическая язва размерами 30 см 30 см, глубиной до 3 см, покрыта темно-серыми грануляциями. Из язвы серой окраски гнойное отделяемое. Лечение Операция 1 Иссечение трофической язвы левой голени,трансплантация коллаген-эластиновой матрицы из ксенобрюшины КРС. (29.11.13 г). Во время операции выполнено иссечение патологических грануляций, рубцовых тканей до визуально жизнеспособных тканей. Для предупреждения высыхания и повторного некроза тканей, защиты раневой поверхности от инвазии микроорганизмов, защиты обнажившихся нервных окончаний раны закрыты коллаген-эластиновым трансплантатом. В послеоперационном периоде отмечается улучшение состояния за счт уменьшения интоксикации, снижение боли. Первая перевязка выполнена на пятые сутки. На перевязке КЭМ плотно прилегает к раневой поверхности. Местами отмечается е расплавление с выделением раневого отделяемого на е поверхность. Повязка снимается легко. Под покрытием бледно-розовая влажная раневая поверхность со скудным гнойным отделяемым. Имеются остатки некротических тканей. После промывания ран растворами антисептиков повторно на поверхность раны наложена КЭМ. На третьи сутки на перевязке КЭМ прилежит к ране. Раневое отделяемое незначительное. Имеется рост здоровых грануляций. 10.12.13 на перевязке КЭМ хорошо прилежит к поверхности раны, легко снимается. После снятия под повязкой гноя нет. Раневая поверхность влажная, покрыта здоровыми мелкозернистыми розовыми грануляциями. Операция 2 Хирургическая обработка гранулирующей раны. Трансплантация аллогенных фибробластов, КЭМ на область раны левой голени(11.12.2013 г). Во время операции выполнена хирургическая обработка гранулирующей поверхности с трансплантацией культивированных фибробластов. Для защиты клеточных культур на рану трансплантирован КЭМ. Операция 3 Аутодермопластика левой голени(13.12.13 г). Во время операции сняты повязки. Под КЭМ имеется приживление аллогенных фибробластов в виде белесоватой плнки. С левого бедра взят расщеплнный кожный трансплантат, перфорирован 12 и трансплантирован на раневую поверхность. Послеоперационный период протекал благоприятно. Перевязка выполнена на пятые сутки после операции. Приживление трансплантатов полное. В послеоперационном периоде проводились перевязки с растворами антисептиков. При выписке раны зажили полностью. Контрольный осмотр через 30 суток. Пациентка в удовлетворительном состоянии. Ран нет. Предложенное авторами изобретения биологическое покрытие хорошо моделируется на поверхности раны, повторяет е рельеф, уменьшает боль, снижает потери жидкости через раневую поверхность. Адгезия к ране слабая, поэтому перевязки малоболезненные. При поверхностных ожогах уменьшается количество перевязок, так как коллаген-эластиновый матрикс создат оптимальный микроклимат для самостоятельной эпителизации раны, препятствует микробной инвазии. Отмечается отсутствие местнораздражающей реакции, что указывает на хорошую биологическую совместимость. При гнойных ранах под КЭМ не происходит скопления гноя, так как покрытие лизируется, то есть происходит его биологическая деградация. Данное свойство является одним из положительных характеристик для перевязочных материалов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Биологическое покрытие для лечения ожогов и ран,состоящее из брюшины животного,отличающееся тем,что ксенобрюшину предварительно обесклеточивают путем промывания в фосфатном буферном растворе содержащем 1 повидон-йод, далее образцы дважды промывают в воде , содержащей 1 пенициллин/стрептомицин/амфотерицин и инкубируют в 4 деоксихолате натрия, затем раствор, разбавляя дистиллированной водой,встряхивают в течение 4 ч. при комнатной температуре, после чего образцы инкубируют с ДНК-азой (2000 единиц) в 1 Ми встряхивают на орбитальном шейкере в течение 3 ч. при комнатной температуре. 2. Биологическое покрытие по п.1. отличающееся тем, что используют брюшину крупного рогатого скота.