Средство для активации восстановления структуры и функций поврежденных тканей и органов

(51) А 61 39/395 (2010.01) 07 16/18 (2010.01) 07 16/28 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(74) Тагбергенова Модангуль Маруповна Тагбергенова Алма Таишевна(54) СРЕДСТВО ДЛЯ АКТИВАЦИИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ ПОВРЕЖДЕННЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ(57) Средство содержит поликлональные иммуноглобулины классасо средней молекулярной массой 150 кД, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов СД 34 (-) мезенхимальных клеток.(72) Кравец Василий НиколаевичГончар Владимир АлександровичРугаль Виктор Иванович(73) Бизяев Алексей Вячеславович 20198 Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим антитела и антигены. Оно может быть использовано для стимуляции биологической активности родоначальных мезенхимальных клеток при лечении заболеваний и травм, требующем регенерации(восстановления) поврежденных тканей и органов. Способность организма к регенерации клеточной структуры и тканей при их повреждениях, например, в случаях инфаркта миокарда, инсульта,патологии костей, сосудов и т. п., определяется тем,что в организме существуют клетки, способные трансформироваться в различные тканевые организации - кроветворную, костную, мышечную,жировую, нервную и т. д...., 2003,349, .570-582.взрослом организме в норме эти клетки участвуют в процессах физиологической регенерации отмирающих клеток. Эти клетки обозначают как латентные клетки персистирующей мезенхимы. Мезенхимальные клетки не имеют антигенов СД 34, СД 44, СД 45 и антигенов МНС комплекса. , 2002,418, .4149. Они локализируются в периостальных,эндостальных,периваскулярных областях организма. В этих же зонах располагаются соматические стволовые клетки. В условиях патологии комплекс неблагоприятных факторов,сформировавшихся в зоне повреждения тканей,искажает или делает невозможным прохождение сигнала с периферии к родоначальным клеткам,чтобы активизировать их и обеспечить регенерацию поврежденных клеток. Требуются регуляторные факторы для каждой клеточной линии. Предшествующий уровень техники. Известно использование аллогенных или аутологичных стволовых кроветворных клеток в качестве регуляторного фактора при лечении различных заболеваний.. , 2001,410, .701- 705. .. , 2000,406, .257. Стволовые клетки могут быть получены из костного мозга, из пуповинной и периферической крови и из эмбриональных тканей. Эффект трансплантации стволовых клеток дозозависим минимальная эффективная доза для реципиента с массой тела менее 10 кг составляет 5108 клеток, для реципиента с массой тела более 50 кг - 25108 клеток Романенко Н.А. Заготовка и хранение ядросодержащих клеток пуповинной крови человека. Автореф. дисс. канд. мед. наук, С.-Петербург, 2000, с.24. Процесс накопления стволовых клеток для трансплантации трудоемок, дорогостоящий и требует серьезных мероприятий по иммуногематологическому подбору пар донор-реципиент, по проведению иммунодепрессии, по профилактике инфекционных осложнений и т.д. Дозозависимость трансплантации стволовых клеток приводит к необходимости накопления большого количества стволовых клеток,что в ряде случаев невозможно, или к применению искусственных стимуляторов их деятельности. ., 2001,105, .829-841. Искусственные стимуляторы деятельности ство 2 ловых клеток обычно вызывают побочные реакции и осложнения у пациентов. Известна также антиретикулярная цитотоксическая сыворотка А. А. Богомольца, использовавшаяся в эксперименте как стимулятор для развития определенных категорий клеток Мягкая И.П. Антиретикулярная цитотоксическая сыворотка А. А. Богомольца как средство патогенетической терапии различных заболеваний. Патол. физиол., 1981, т.2, с.39-46. Указанная сыворотка получена при иммунизации животного,например, лошади, смесью тканей костного мозга человека, клеток селезенки и лимфатических образований кишечника, без их фенотипической идентификации. Из крови иммунизированного животного отделяли форменные элементы крови, и сыворотка,содержащая иммуноглобулины,образовавшиеся как гуморальный иммунный ответ,использовалась в качестве сыворотки. Недостатками антиретикулярной цитотоксической сыворотки А. А. Богомольца является ее низкая избирательность в активации клеток персистирующей мезенхимы, поскольку для иммунизации лошадей использованы ткани костного мозга целиком, без отбора зон, наиболее богатых мезенхимальными клетками, что делает попадание этих клеток в состав антигена непредсказуемым. Использование в антигенном материале клеток селезенки и лимфатических образований кишечника приводит к отвлечению иммунологической потенции иммунизируемого организма на выработку иммуноглобулинов, не проявляющих активности к клеткам персистирующей мезенхимы, что также снижает избирательность сыворотки. Кроме того, сыворотка содержит балластные белки, неактивные в иммунологическом отношении,но сенсибилизирующие организм больного и способные вызвать аллергические реакции. Раскрытие изобретения. В основу изобретения поставлена задача повышения избирательности средства в активизации клеток персистирующей мезенхимы. Согласно изобретению предложено средство для восстановления структуры и функций поврежденных тканей и органов, содержащее поликлональные иммуноглобулины классасо средней молекулярной массой 150 кД, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов СД 34(-) мезенхимальных клеток. Заявляемое средство для восстановления структуры и функций поврежденных тканей и органов может быть получено как ксеногенный гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов СД 34(-) мезенхимальных клеток. Иммуноглобулины класса , подклассов 14 имеют одинаковые константные регионы с постоянной последовательностью аминокислот и различные вариабельные участки различие в вариабельных участках приводит к различию основных эффекторных характеристик. Выработанные как результат гуморального ответа на СД 34(-) мезенхимальные клетки, они стимулируют 20198 биологическую активность родоначальных мезенхимальных клеток (клеток персистирующей мезенхимы), что приводит к регенерации поврежденных тканей и органов. Таким образом,указанное средство имеет широкие перспективы использования в клинической практике. Заявляемое средство может быть получено следующим образом. Для получения антигена трепанобиоптат донорского костного мозга, включающий эндостальные и периостальные мезенхимальные клетки, отмывали от паренхимы костного мозга форменных элементов крови физиологическим раствором, измельчали механическим перетиранием до однородного состояния и взвешивали в физиологическом растворе. Однородную взвесь центрифугировали со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость трижды замораживали и оттаивали, после чего снова перетирали и центрифугировали соскоростью 3000 об/мин. Содержание белка в надосадочной жидкости определяли биуретовым методом и доводили разбавлением физиологическим раствором до концентрации 2,2 мг/мл. Полученный таким образом антиген вводили животному в количестве 2,2 мг/мл в расчете на 1 кг массы тела иммунизируемого объекта. В качестве иммунизируемого животного могут быть использованы любые биологические объекты,способные дать гуморальный иммунный ответ, на введение чужеродного белка, например, домашний и крупный рогатый скот. Первая инъекция антигена проводилась в полном адъюванте Фрейнда или иного стимулятора иммунного ответа. Последующий инъекции проводились с интервалом 2-7 дней так, чтобы весь курс иммунизации занимал 2050 дней. У иммунизированного объекта забирают кровь в стерильную посуду без консервантов и антикоагулянтов. Норма забора крови у животного не превышает 10 мл крови на 1 кг массы тела. После осаждения форменных элементов крови и формирования сгустка надосадочную жидкость(сыворотку) перенесли в другой стерильный сосуд. Иммуноглобулиновые фракции выделили из надосадочной жидкости высаливанием, осадок отделили, растворили в дистиллированной воде и разделили на фракции хроматографически. Фракцию, соответствующую классу , вымыли специальным элюатом и очистили диализом через полупроницаемую мембрану. Очищенный раствор стерилизовали фильтрацией, дозировано разлили и высушили в вакууме или атмосфере инертного газа до остаточной влажности 2-5. Ампулы запаивали. Каждая ампула содержала разовую дозу заявляемого средства. Хранение препарата осуществляли при 4 С в тмном месте сроком не более 24 месяцев. В качестве источника антигенного материала донорских СД 34(-) мезенхимальных клеток человека могут быть использованы мезенхимальные ткани периостальных,эндостальных и интерстициальных пространств костного мозга. Трепанобиоптаты костного мозга, полученные от здоровых доноров, обрабатывают, как указано выше. Полученный антиген, содержащий СД 34(-) мезенхимальные клетки, можно использовать сразу или хранить в замороженном виде до употребления. Варианты осуществления изобретения. Изобретение далее иллюстрируется примерами получения и применения заявляемого средстваи. Пример. Иммунизации подвергли здоровую козу с массой тела 25 кг. В четырех различных точках тела ей ввели по 55 мг антигена, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Спустя 14 дней вводили парентерально без адъюванта 6 раз такое же количество антигена с интервалами между инъекциями 2-4 дня. Суммарная доза антигена составила 155 мг х 73,85 мг. Контроль титра антител (иммуноглобулинов) к мезенхимальным клеткам проводили перед каждой инъекцией, начиная с 4-ой. Перед пятой инъекцией титр антител составил 1512, перед шестой - 11024,перед эксфузией крови 12048. Через 7 дней после последнего введения антигена из яремной вены козы взяли без консерванта 250 мл крови. Сыворотку отделили от сгустка и форменных элементов крови центрифугированием при скорости 3000 об/мин в течение 30 минут. Из сыворотки осадили полиглобулиновую фракцию добавлением насыщенного раствора сульфата аммония. Надосадочную жидкость отделили центрифугированием,осадок растворили в дистиллированной воде,концентрация белка в растворе составила 5 мг/мл. Раствор ввели в хроматографическую колонку и после разделения на фракции иммуноглобулиныэлюировали 0,025 М трис-НСЕ рН 7,8-0,15 М трис НСЕ буфером с рН 7,8. Раствор подвергли диализу через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды в течение 2 суток. После диализа раствор иммуноглобулинов стерилизовали фильтрацией через миллипоровские фильтры 0,22 мкм. Жидкий стерильный раствор разлили по 1 мл в ампулы. Содержание белка в одной дозе составило 5 мг. Сушку лиофилизацией проводили в режиме лиофилизации иммуноглобулинов (от -60 С до 37 С). Ампулы герметически запаивали. До использования средство хранили при 4 С. Титр антител в готовом препарате составил 11200 к антигенам СД 34 (-) мезинхимальных клеток. Остаточная влажность 3 масс. Лиофилизированный препарат представляет собой белую пористую гигроскопическую массу, растворяющуюся без остатка в воде или физиологическом растворе при комнатной температуре в течении 60 сек. Содержимое ампулы растворяется в 1 мл воды,раствор прозрачный, слегка опалесцирующий. Препарат исследовался на стерильность, токсичность и апирогенность в соответствии с регламентированными методиками. Специфическую безвредность определяли по его способности вызвать гемагглютинацию и тромбоагглютинацию в соответствующих тестах, а так же лимфотоксичность в микролимфоцитотоксическом тесте по методу Терасаки Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. С.-Петербург, 1998,3 20198 с.156 при действии на форменные элементы крови концентратами заявляемого средства. В испытуемых разведениях препарат не обладал токсическими свойствами. Морфологические исследования при световой и электронной микроскопии не выявили токсических признаков - вакуолизации и нарушения структуры цитоплазмы, е окраски стандартными красителями,- целостность органелл клеток не нарушена. Специфическую активность полученного средства определяли следующим образом. Для изучения действия заявленного средства на рост мезинхимальных клеток и их потомков был проведн эксперимент. Мезенхимальные клетки и их потомки были извлечены из фрагментов губчатой кости человека,взятых при трепанобиопсии. Фрагменты губчатой кости помещали в питательную среду в чашках Петри в газопроточный инкубатор при температуре(36,80,2)С. В опытные чашки добавляли заявляемое средство в дозе 0,0125 мкг/мл питательной среды. Выдержка в инкубаторе составляла 2 недели. Микроскопически определяли число клеточных агрегатов (3 и более клеток) на покровном стекле площадью 567 мм. Результат сравнивали с образцами, в которые не было введено заявляемое средство (время выдержки и е условия те же). Результаты исследования представлены в таблице. Таблица. Количество клеточных агрегатов на один образец биоптата Нормопластический тип Гипопластический тип Контроль Опыт Контроль Опыт Количество Количество Количество Количество Количество Количество Количество Количество агрегатов клеток в агрегатов клеток в агрегатов клеток в агрегатов клеток в агрегатах агрегатах агрегатах агрегатах 5-9 20-45 10-12 30-50 2-4 6-12 5-7 15-21 Из таблицы видно, что введение заявляемого средства приводит к увеличению агрегатов при гипопластическом типе до нормы, а при нормопластическом - увеличивает на 30 и более от исходного состояния. Для демонстрации активности заявляемого средства проведн эксперимент. Для получения антигена были взяты фрагменты губчатой кости крыс Вистар, содержащие мезенхимальные клетки. Биоптат был обработан так же, как описано выше при работе с человеческим материалом. Для получения иммуноглобулинов, иммунизации подвергли кролика с массой тела 2,2 кг. Иммунизация проводилась 6 раз, антиген был взят в количестве 4,4 мг на каждую инъекцию. Перед 6-й инъекцией титр антител составлял 11024. Препарат получали как описано выше. Кровь иммунизированного кролика взяли на седьмые сутки после 6-й инъекции. После ретракции кровяного сгустка сыворотку снимали пипетками и центрифугировали 20 мин. при скорости 2500 об/мин. Из выделенной сыворотки препарат получал, как описано выше. 8 крысам Вистар производили механический перелом костей голени. Лечение начинали в день перелома. 4 крысы опытной группы получали 5 внутримышечных инъекций иммунного препарата ежедневно 2 крысы не получали никаких инъекций две крысы получали 5 инъекций неимунного препарата. Препараты растворяли в 1,0 мл воды для инъекций, вводили из расчта 0,1 мл/кг тела животного. На 7-е сутки после первой инъекции были забиты путм декапитации под эфирным рауш-наркозом 2 крысы из опытной группы и по одной из чистого контроля и контроля лечения. Препараты зон повреждения голени исследовались гистологически. 4 На 7 день у животных контрольных групп выявлено образование фиброзной ткани, в 2-4 раза превышавшее объм хряща. В регенерирующих участках развития сосудов шло, но их общая площадь в поле зрения не превышала 6. У животных опытной группы на 7 день наблюдалось отчетливое преобладание хрящевой ткани над фиброзной и появление зачатков остеогенной ткани над областями фиброретикулярной ткани. Площадь формирующейся сосудистой ткани в зоне регенерации составляла 23. На 14 день у животных контрольной группы наблюдалось формирование костной мозоли, на периферии которой преобладали фиброзная и хрящевая ткани. Объем хрящевой ткани увеличился и стал равен объему фиброзной. Площадь формирующихся сосудов увеличилась до 9. Сформировались одиночные костные балки в зоне периоста, возле которых обнаруживалось формирование эндотелия. У животных опытной группы на 14 день костная мозоль была сформирована костной тканью и хрящом. Костные балки формировались на всем протяжении костной мозоли. За счт образования костной ткани площадь пронизывающих сосудов уменьшилась до нормы 14,5. В развивающихся сосудах эндотелиальные клетки характеризовались признаками высокой функциональной активности, а именно наличием обильной цитоплазмы, содержащей крупные ядра. Признаков дегенерации ткани или появления атипичных клеточных форм не выявлено. Таким образом, результатом применения сыворотки при лечении механического перелома трубчатых костей в эксперименте было полноценное формирование костной мозоли в более ранние сроки. Техническая применимость. 20198 Заявляемое средство может применяться при лечении заболеваний, приводящих к нарушению клеточной структуры и тканей и требующих их регенерации. Оно может выпускаться биотехнологической отраслью фармацевтической промышленности. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Средство для активации восстановления структуры и функций поврежденных тканей и органов,включающее иммуноглобулин, отличающееся тем,что в качестве иммуноглабулинов средство содержит поликлональные иммуноглобулины классасо средней молекулярной массой 150 кД, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов СД 34(-) мезинхимальных клеток. 2. Средство для активации восстановления структуры и функций поврежденных тканей и органов по п.1, отличающееся тем, что оно содержит ксеногенные поликлональные иммуноглобулины класса к комплексу антигенов СД 34(-) мезинхимальных клеток.