Способ избирательного комплемент зависимого лизиса трансформированных клеток

(51) 61 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к медицине, а именно к способам лизиса трансформированных клеток. Повышение эффективности лечения достигается тем, что в способе избирательного комплемент зависимого лизиса трансформированных клеток,включающем введение в организм реципиента противоопухолевого лекарственного средства,согласно изобретению,в качестве противоопухолевого лекарственного средства используют нормальные иммуноглобулины человека.(56) Роит А., Брестофф Д., Мейл Д. Иммунология. М. Мир, 2000, с. 61-62. Бургасов П.Н Руководство по вакцинному и сывороточному делу. - М. Медицина, 1978. с. 325326.(54) СПОСОБ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО КОМПЛЕМЕНТ ЗАВИСИМОГО ЛИЗИСА ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК 21097 Изобретение относится к медицине, а именно к способам лизиса трансформированных клеток. Известен способ лизиса измененных клеток путем воздействия на них препаратом Вепезид,активным веществом которого является этопозид. Этопозид обладает способностью прерывать клеточный цикл на стадии 2.Вепезид подавляет включение тимидина в ДНК. Высокие концентрации (более 10 мкг/мл) ведут к лизису клеток, находящихся в митозе. Вепезид эффективен в эксперименте против ряда опухолей животных, а в клинике против ряда опухолей человека, в том числе таких, как мелкоклеточная карцинома бронхов, злокачественный лимфогрануломатоз(болезнь Ходжкина) и лимфома на продвинутых стадиях, острая рецидивирующая нелимфоцитарная лейкемия, несеминомная карцинома яичка (Список лекарственных средств, зарегистрированных и разрешенных к медицинскому применению на территории РК - Алматы ЭМИТИ Интернешнл,2003). Недостатком препарата является высокая гематологическая токсичность(лейкопения,тромбоцитопения),желудочно-кишечная токсичность, анорексия. Известен способ лизиса трансформированных клеток, при котором используют антитела,обладающие способностью при участии компонентов комплемента избирательно связываться с клеточными рецепторами антигенами (А. Роит, Дж. Брестофф, Д. Мейл. Иммунология, М, Мир, 2000 г, стр. 61-62). Недостатком данного способа является его низкая эффективность. Задачей изобретения является усовершенствование способа избирательного лизиса трансформированных клеток. Повышение эффективности лечения достигается тем, что в способе избирательного комплемент зависимого лизиса трансформированных клеток,включающем введение в организм реципиента противоопухолевого лекарственного средства,согласно изобретению,в качестве противоопухолевого лекарственного средства используют нормальные иммуноглобулины человека. Предлагаемый способ расширяет область клинического применения нормального иммуноглобулина человека. До настоящего времени иммуноглобулины использовали для восполнения недостаточного количества собственных иммуноглобулинов в сыворотке крови человека при различных заболеваниях или при укусах ядовитых змей и насекомых. Различают иммуноглобулины,содержащие специфические антитела (сыворотки), получаемые из плазмы крови человека или животных,предварительно гипериммунизированных целевым антигеном (вирусы, микроорганизмы, токсины и др.). Среди таких иммуноглобулинов хорошо известны- Иммуноглобулин против клещевого энцефалита человеческий жидкий- Сыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная(В.Г. Гудков, А.С. Виринская, В.Н. Головачева, С.В. Дорогова, М.О. Коржев, Д.Р. Микицкий, В.В. Москалев,Р.Д. Гулькович Разработка специфического лактоиммуноглобулина для лечения и профилактики ротавирусной инфекции. Беларуский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии 2001 г). Кроме того, используются иммуноглобулины человека и животных, организм которых не был предварительно иммунизирован каким - либо агентом. Такие лекарственные препараты называются нормальными иммуноглобулинами(лактоиммуноглобулинами). Сырьем для выделения иммуноглобулина человеческого нормального служит абортная и/или плацентарная кровь (П.Н. Бургасов, Руководство по вакцинному и сывороточному делу- М. Медицина, 1978, стр. 325 - 326). Получают препарат из объединенных порций(пула) плазмы крови, не менее чем от 3600 женщиндоноров. Выделяют фракцию иммуноглобулинов из смеси белков плазмы крови любым из известных методов фракционирования белков (Броновицкая З.С.,Горетов В.П. Высаливание белков сернокислым аммонием при низких температурах. Таблицы и номограмма. Прикладная биохимия и микробиология, 1967,3, стр. 707-709), но чаще всего используют спиртовый метод фракционирования по Е. Кону. В продажу иммуноглобулин человеческий нормальный поступает под разными торговыми названиями - Октагам (, Швейцария),Пентаглобин, Италия) Габриглобин (Ивановская областная станция переливания крови, Россия), Гамимун (Байер,Германия) и др 1. Показанием к применению иммуноглобулина человеческого нормального является клиническая целесообразность восполнения природных антител в сыворотке крови больного. Применение иммуноглобулина человеческого нормального апробировано в следующих областях Для заместительной терапии с целью профилактики инфекций у больных с синдромами первичного иммунодефицита 21097 В качестве заместительной терапии для профилактики инфекций у больных с синдромом вторичного иммунодефицита,обусловленным следующими состояниями- Пересадкой костного мозга (аллогенной трансплантации). В качестве средства для иммуномодуляции и подавления воспаления- Синдроме Кавасаки (в дополнение к лечению препаратами ацетилсалициловой кислоты). Кроме того, в результате проведенных исследований положительные эффекты от применения препарата обнаружены при следующих состояниях- При тяжелых инфекциях бактериального происхождения (включая сепсис) или вирусных инфекциях в комбинации с антибиотиками- При послеоперационных осложнениях,сопровождающихся бактериемией и септическим состоянием, для профилактики оппортунистических инфекций- При бактериальном менингите (в составе комбинированной терапии)- Для профилактики инфекций у недоношенных детей с малым весом при рождении (1500 г)- При хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии- При нейтропении аутоиммунного происхождения и аутоиммунной гемолитической анемии- При истинной эритроцитарной аплазии,опосредованной через антитела (парциальная красноклеточная аплазия кроветворения)- При тромбоцитопении иммунного происхождения,например,постинфузионной пурпуре или изоиммунной тромбоцитопении новорожденных (особенно при острых формах у детей)- При гемофилии, вызванной образованием антител к фактору Р (фактору свертывания)- Для профилактики и лечения инфекций при терапии цитостатиками и иммунодепрессантами- Для профилактики рецидивирующего спонтанного выкидыша. Таким образом, препараты иммуноглобулина человеческого нормального применяются,в основном, в качестве пассивной заместительной иммунотерапии при инфекционных заболеваниях различной природы, а также в качестве иммуномодулирующего средства,предотвращающего развитие некоторых аутоиммунных заболеваний. В области трансплантологии и онкологии иммуноглобулин человеческий нормальный используется только как средство для профилактики инфекций при применении цитостатиков и иммунодепрессантов. Никогда иммуноглобулин человеческий нормальный не рекомендовался к использованию и не применялся в качестве целевого противоопухолевого лекарственного средства для избирательного разрушения измененных клеток. Противоопухолевый препарат Нормоген,представляющий собой сумму нормальных иммуноглобулинов животных, в присутствии комплемента (белковый компонент сыворотки крови), вызывает избирательный комплемент зависимый лизис трансформированных клеток в исследованияхи 2. Особенностью получения иммуноглобулинов для производства препарата Нормоген, является то, что в качестве сырья используются физиологические жидкости (сыворотка крови,сыворотка молока, лимфа и др.) животных,находящихся в состоянии беременности или лактации. Использование иммуноглобулинов животных при производстве препарата Нормоген обусловлено абсолютной безопасностью их по переносимым заболеваниям, таким как сифилис,гепатиты, СПИД и др. Выделение нормальных иммуноглобулинов из суммы белков сывороток, лимфы или других физиологических жидкостей проводят любым из известных методов фракционирования белковых смесей. Однако всем иммунобиологическим препаратам,выделенным из тканей и физиологических жидкостей животных,характерно высокое иммунизирующее действие на организм реципиента. Это вызывает синтез защитных антител против таких препаратов и их нейтрализацию, что снижает терапевтический эффект и сенсибилизирует организм больного. Ввиду физиологической и функциональной идентичности нормальных иммуноглобулинов сыворотки животных и человека, следует также ожидать проявления избирательного, комплемент зависимого лизиса трансформированных клеток человеческим нормальным иммуноглобулином. Способ осуществляют следующим образом. Пример 1. Для определения избирательной,комплемент зависимой цитолизирующей активности нормальных иммуноглобулинов человека использовалась сумма иммуноглобулинов(лактоиммуноглобулинов), выделенных из женского молока. Для избирательного разрушения опухолевых клеток при лейкозе использовали нормальные иммуноглобулины(лактоиммуноглобулины) человека в смеси с равным количеством комплемента (препарат) в экспериментах. Проверка действия препарата на клетки крови. Материал периферическая кровь 4-5 мл в гепарине. Последовательность 1. Отстаивание в течение 1 часа. 2. Отделение плазмы. 3. Центрифугирование 10 мин при 1000 об/мин. 4. Выделение осадка. 3 21097 5. Разделение его на 2 части. 6. Из 1-ой части готовится 1 мазок и высушивается. 7. 2-ая часть осадка делится на 3. 8. Действие препарата на осадок клеток,разведенного физ. раствором до концентрации 25 мг/мл. В каждую пробу добавляли по 2 капли раствора препарата (2,5 мг). 9. Инкубация - в термостате (37 С), от 5 мин до 3 часов ( - 5 мин, 30 мин, 1 ч- 1,5 ч, 2 ч, 3 ч). 10. Приготовление мазков, высушивание и окрашивание по Май -Грюнвальду - Романовскому. 11. Анализ окрашенных мазков при обычной микроскопии под иммерсионной системой. Результаты Доноры 1. 5 мин, 30 мин, 1 ч - препарат не действует. 2. 5 мин, 30 мин, 1 ч - появление глыбчатой структуры хроматина в лимфоцитах при действии препарата в 1 ч., препарат не действует. 3. 5 мин, 30 мин, 1 ч - рыхлая структура хроматина, препарат не действует. 4. Через 1 ч изменение структуры у части клеток, увеличение размера ядер, увеличение числа плазматических клеток. Лейкоз у больных (5 человек) из отделения гематологии больницы Калкаман в возрасте от 28 до 75 лет. Условия - действие препарата от 1,5 ч до 3 ч. 1. 1,5 ч. - инкубации-изменений нет 2.ч.- инкубации - рыхлые клетки. 3. ч. - инкубации - отдельные фрагменты хроматина в лимфоцитах, лизис. 2. 1,5 ч.- инкубации - фрагменты хроматина плюс нормальные лимфоциты. 2.ч.- инкубации - глыбки хроматины 3. ч.- инкубации -глыбки хроматины, лизис. 3. 1,5 ч.- инкубации -глыбки хроматины 2. ч.- инкубации - глыбки хроматины, рыхлые структуры 3.ч.- инкубации -ядра-тени (остов ядра, лизис). 4. 1,5 ч.- инкубации - глыбки хроматины 2. ч.- инкубации - ядра-тени, двух ядерные плазматические клетки, фигуры деления. 3. ч.- инкубации -мелкозернистая структура хроматина, огромные лимфоциты, лизис. 5. 1,5 ч.- инкубации - мелкозернистая структура хроматина, клеток мало. 2. ч.- инкубации - фрагменты хроматина, лимфоциты единичные, лизис клеток. 3. ч.- инкубации -рыхлая структура хроматина,клетки единичны, лизис. В лейкозных клетках через 3 ч. действия препарата обнаруживается лизис клеток с появлением ядер-теней - остается остров ядра в виде теневых очертаний - следы разрушенных клеток. Таким образом, в препаратах крови от лейкозных больных, на фоне достаточного количества патологически измененных бластных клеток,выявлен эффект лизиса - гибели клеток,выражающийся в виде остаточных теней - контуров,не воспринимающих основной краситель - Гимза Романовского, окрашивающего ядерные структуры. 4 противоопухолевой активности препарата Проверка проводилась на больном Г., возраст 56 лет, амбулаторная карта 5117006 (поликлиника МВД, г. Алматы). Согласно записям онколога в амбулаторной карте, больному Г., в 1993 г. была проведена близкофокусная рентгенотерапия по поводу базалиомы кожи лба, справа. В 1993 году было проведено оперативное лечение по поводу гиперкератоза левой ушной раковины (биопсия 5886 - 5891,. цитологическое заключение плоскоклеточный рак). При осмотре больного Г. онкологом, в 1994 году,отмечается два места гиперкератоза кожи шеи справа, которые к концу 1998 г. превратились в единое новообразование, размером 1,5 х 0,9 х 0,8 см., выступающее над уровнем кожи шеи, хорошо различимое на фотографии 1 Кроме того, на коже груди больного Г., в районе левого соска, имелось сосудистое образование размером 0,6 х 0,7 см,выступающее над поверхностью кожи на 0,7 см (фотография 1). В период времени с 1994 г. по 1998 г. больному Г. лечение по поводу новообразований не проводилось. Для воздействия на новообразования,локализованные на коже шеи и в районе левого соска больного Г., применялась смесь из равных количеств лактоиммуноглобулинов человека и комплемента. Указанной смесью новообразования на коже шеи и в районе левого соска смазывались 2 раза в день в течение 1,0 месяца. В течение указанного периода времени происходило разрушение новообразования на шее больного Г. и отделение верхней его части от уровня кожи. Динамика процесса разрушения новообразования на коже шеи показана на фотографиях 2- 5. Микроскопия отделившейся от кожи шеи части новообразования показала наличие в исследуемом материале массы кератина с кальцинатами и клеток- теней. Опухолевых клеток не найдено (биопсия 500 от 29.01.99 г.). По результатам микроскопического исследования хирургически иссеченного основания новообразования на коже шеи (биопсия 1496 от 08.02.99 г.) поставлен диагнозкератоакантома с дисплазией эпителия и начальной малигнизацией. На фотографиях 6-9, показаны результаты месячного воздействия препарата на новообразование на коже груди в районе левого соска больного Г. В ходе микроскопического исследования хирургически иссеченного новообразования на коже груди, в районе левого соска, установлено изменение ткани кровеносного сосуда - гемангиома(биопсия 1496 а от 08.02.99 г.). Как видно из данных фотографий 6 - 9, в ходе лечения новообразования в районе соска изменений 21097 в форме или его геометрических размерах, не отмечено, так как оно находилось под нормальными клетками эпидермиса кожи. Пример 3. Аналогичные результаты по избирательному комплемент зависимому лизису избыточно делящихся, трансформированных клеток в экспериментахбыли получены при использовании официальных лекарственных препаратов нормального иммуноглобулина человека. Из серийных, промышленных препаратов в исследованиях по избирательному, комплемент зависимому лизису измененных клеток,использовался лекарственный препарат лиофилизированный порошок нормального иммуноглобулина человека для внутривенного введения,под торговым названием Иммуновенин, производства НПО Микроген(Россия). Больной Р. 1938 г.р. Проходил обследование по поводу аденомы предстательной железы в лечебном центре ИФС-1 г. Алматы Согласно заключению от 19.01.07 г. объем предстательной железы, по данным ультразвукового исследования, составлял 52,8 см 3. Рекомендована операция. После применения с 15.03.07 г., в качестве лечебного средства препарата нормального иммуноглобулина человека объем предстательной железы уменьшился до 30,9 см 3. (результаты ультразвукового исследования предстательной железы в ГККП Региональный диагностический центр г. Алматы. от 19.04.07 г.). Необходимости в операции нет. Таким образом, в экспериментахипоказана способность нормальных иммуноглобулинов человека к избирательному, комплемент зависимому лизису избыточно делящихся,трансформированных клеток. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ избирательного комплемент зависимого лизиса трансформированных клеток, включающий введение в организм реципиента противоопухолевого лекарственного средства,отличающийся тем,что в качестве противоопухолевого лекарственного средства используют нормальные иммуноглобулины человека. Результаты инкубации культуры нормальных (донор) и измененных (лейкоз) клеток в среде 199, содержащей нормальные лактоиммуноглобулины человека и равное количество (по содержанию белка) комплемента Избирательное действие препарата на измененные (раковые) и нормальные клетки кожи человека 5