Способ приготовления вакцины инактивированной против репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)

(51) 61 39/12 (2006.01) 12 7/00 (2006.01) 12 7/04 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ активностью в нативном виде и после инактивации и пригодного для изготовления инактивированного вакцинного препарата, создающего напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории республики эпизоотических изолятов вируса РРСС. Сущность изобретения способ приготовления включает культивирование вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток(клоновый вариант клеток почки эмбриона макаки резус МА-104) 2-х суточного возраста, выращенных в сосудах (1,5 дм 3) в стационарных условиях при температуре (370,5) С в течение 72-96 час и сбор вирусной биомассы после 2-кратного замораживания (при минус 40 С) и оттаивания (при комнатной температуре) инфицированных клеток с соблюдением стерильных условий, инактивацию вируса димерэтиленимином и диспергирование смеси с адъювантом 01 ,содержащим полиакриловый полимер. Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных вакцин против РРСС, обладающих высокой иммуногенной активностью и безвредностью и создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории Республики Казахстан эпизоотических изолятов вируса РРСС. Приготовленный данным способом препарат сохраняет свои иммунобиологические свойства при температуре хранения (42)С в течение 8 мес.(72) Мамбеталиев Муратбай Табынов Кайрат Казыбаевич Ажибаев Азамат Жасуланович Абсатова Жаркинай Серикбаевна Битешова Эльмира Туракбаевна Кенжебаева Маржан Кулкубековна Сансызбай Абылай Рысбайлы(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ (РРСС)(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней(РРСС). В задачу создания настоящего изобретения входило разработать высокоиммуногенную и безвредную инактивированную вакцину против РРСС на основе нового эпизоотически актуального штамма вируса, выделенного на территории Республики Казахстан, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной Область техники Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней(РРСС). Уровень техники Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС,включающий получение антигенного материала из штамма 1-1102 гомологичного вируса,репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта РСТ 92/21375, А 61 39/12,01 33/569, С 12 7/00, 10.12.92 г. Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС,включающий получение антигенного материала из штамма 1-1140 гомологичного вируса,репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта РСТ 93/07898, А 61 39/12,01 33/569, С 12 7/00, 29.04.93 г. Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС,включающий получение антигенного материала из штамма 1-1153 гомологичного вируса,репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта Пат. Франции 2682966, С 127/02, 04, 30.04.93 г Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС,включающий получение антигенного материала из штамма 1-1387 или 1-1388 гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей,инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта ЕР 0676467,С 12 7/00, А 61 39/12, С 12 Р 21/08, С 07 16/10,11.10.95 г Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС,включающий получение антигенного материала из штамма АТСС -2402 гомологичного вируса,репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта Пат. США 5587164,А 61 39/00, 39/12, 39/38, 39/193, 24.12.96 г Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС,включающий получение антигенного материала из штамма АТСС -2509 гомологичного вируса,репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта Пат. США 5690940,С 12 15/38, 7/01, 25.11.97 г Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС,включающий получение антигенного материала из штамма АТСС -2525 гомологичного вируса,репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта Пат. США 5866401,С 12 7/08, 7/01, 7/00, 7/02, 02.02.99 г Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС,включающий получение антигенного материала из штамма ЕСАСС -93070108 гомологичного вируса,репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта Пат. Великобритании 2282811, С 12 15/40, А 61 39/12, С 07 14/18,С 12 7/02, 7/04, 19.04.95 г Сущность изобретения Задача разработать способ приготовления иммуногенной и безвредной инактивированной моновалентной вакцины против РРСС на основе эпизоотически актуального штамма вируса,выделенного на территории Республики Казахстан,обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодного для изготовления инактивированного вакцинного препарата,создающего напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории республики изолятов вируса РРСС североамериканского генотипа. Решение поставленной задачи достигается следующим образом инактивированную вакцину против РРСС готовят из матрового вируса штамма А//2010,выращенного в перевиваемой культуре клеток -145 2-сут возраста с концентрацией клеток более 100 тыс. кл./см 3. Матровый вирус считается пригодным для наработки вирусного сырья, если он соответствует следующим требованиям титр инфекционности после репродукции в монослое клеток -145 4,50 ТЦД 50/см 3 и при отсутствии контаминации. Для изготовления вакцины берут матрасы с культурой клеток емкостью 1,5 дм 3. После слива ростовой среды и однократного отмывания раствором Хенкса или питательной средой Игла в матрасы вносят вируссодержащий материал матровой серии. Адсорбцию вируса проводят при 37 С в течение часа. После этого в матрасы вносят среду Игла в объеме 150-200 см 3 с добавлением 5 фетальной сыворотки КРС с антибиотиками(гентамицин в концентрации 50 мкг/см 3 или его аналоги). Культивирование ведут при 37 С в течение 7296 час. Для контроля незараженными оставляют 3 матраса, в которых заменяют среду. Размножение вируса в культуре клеток -145 определяют по характеру ЦПД с образованием скопления шарообразных клеток,поднимающихся над монослоем. В контрольных матрасах не должно быть каких-либо деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением до 70 клеточного монослоя (обычно через 72-96 часов), отбирают и замораживают при минус 40 С. Вирус для изготовления вакцины получают 3-кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим сливом содержимого матрасов в одну емкость, соблюдая стерильные условия. Полученный вирус очищают от балластных примесей(клеточного детрита) центрифугированием при 900 в течение 20 мин. Очищенная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости золотистого цвета. Затем из емкости отбирают пробу для лабораторнопроизводственного контроля на инфекционную активность и стерильность. Производственная серия вируса РРСС считается пригодной, если она соответствует следующим требованиям титр инфекционности после репродукции в монослое клеток -145, по меньшей мере, 4,0 ТЦД 50/см 3 и при отсутствии контаминации. Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Инактивацию наработанного вирусного сырья ведут с помощью 8 водного раствора( 7,6-7,8) димерэтиленимина (ДЭИ), вносимого в конечной концентрации 0,1. Инактивацию ведут при комнатной температуре (222)С в течение 24 час с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации остаточное действие ДЭИ в суспензии нейтрализуют путем добавления 25 раствора тиосульфата натрия в конечной концентрации 0,25, затем суспензию охлаждают до 4-6 С и отбирают пробы антигена для проверки на стерильность и авирулентность. Вакцину готовят путем диспергирования смеси антигенсодержащего материала и адъюванта,содержащего полиакриловый полимер. Из адъювантов используют препарат 01 фирмы(Франция). Тип получаемой рецептуры вода-полимер. Адъювант и инактивированный антиген соединяют в весовом соотношении 110 (на 1 г адъюванта 9 г антигена). Для получения стабильной рецептуры адъювант 01 разбавляют в водной антигенной среде при комнатной температуре и тщательно перемешивают вручную в сосуде путем взбалтывания в течение 5 мин. Готовую вакцину собирают в стерильную емкость, фасуют при помощи дозирующего устройства в стерильные стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями. Вакцину считают иммуногенной, если у трех подсвинков, привитых трехкратно (0, 21 и 35 сут) в дозе 2 см 3, через 49 сут после вакцинации в сыворотке крови выявляют специфические антитела к вирусу РРСС с уровнем оптической плотностью не менее 0,4 в ИФА (, Корея) и у всех животных при контрольном заражении не отмечают клинических признаков заболевания. Вакцину считают безвредной, если при подкожном введении цельной вакцины пяти белым мышам массой 18-21 г в объеме 0,5 см 3 и при внутримышечном введении двум подсвинкам массой 20-25 кг в объеме 5 см 3,она не вызывает заболевания или гибели лабораторных животных в течение 10, а подсвинков - в течение 15 сут наблюдения. На месте введения не должно быть никаких изменений подкожной клетчатки. Вакцина представляет собой рецептуру золотистого непрозрачного цвета с очень низкой вязкостью. При хранении допускается незначительное осаждение геля на дне сосуда. При встряхивании вакцина приобретает однородную гомогенную структуру. Приготовленный данным способом препарат сохраняет свои иммунобиологические свойства при температуре хранения (42)С в течение 8 мес (срок наблюдения). Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных вакцин против РРСС, обладающих высокой иммуногенной активностью и безвредностью и создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории республики эпизоотических изолятов вируса РРСС североамериканского генотипа. Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении инактивированной вакцины против РРСС используют антигенный материал штамма //2010 вируса РРСС североамериканского генотипа, обладающего высокой биологической,антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, и обеспечивающего получение высокоиммуногенной и безвредной вакцины,создающей напряженный и длительный иммунитет у привитых свиней. Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что инактивацию антигенного материала осуществляют с помощью ДЭИ, что позволяет значительно снизить трудои энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенного материала. Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части 3 повышения антигенной и иммуногенной активности целевого продукта достигается за счет использования в его составе нового адъюванта 01(, Франция) на основе полиакрилового полимера. Штамм А//2010 депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под регистрационным номером М-2-11/Д. Штамм//2010 является безвредным и обладает высокой биологической,антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления вакцинных препаратов. Проведенный заявителем анализ уровня техники,включающий поиск по патентным и научнотехническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить,что заявитель не обнаружил источники,характеризующиеся признаками, тождественными(идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа,изложенных в независимом пункте формулы изобретения. Следовательно,заявляемое решение соответствует условию патентоспособности новизна. Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности изобретательский уровень проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков,включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали,что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки,совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно,предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности изобретательский уровень. Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий- способ приготовления инактивированной вакцины против РРСС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно, в ветеринарной вирусологии и биотехнологии- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов- при использовании предлагаемого способа приготовления инактивированной вакцины против РРСС достигается технический результат,предусмотренный задачей создания изобретения. Следовательно,предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности промышленная применимость. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления вакцины инактивированной против репродуктивнореспираторного синдрома свиней(РРСС),включающий получение антигенного материала,инактивацию вируса, соединение антигенного материала с адъювантом и последующий контроль целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве возбудителя инфекции используют выделенный на территории Республики Казахстан эпизоотически актуальный штамм//2010 вируса РРСС,репродуцированный в перевиваемой культуре клеток -145, из инактивантов используют димерэтиленимин в конечной концентрации 0,1, а в качестве иммуностимулятора новый адъювант на базе полиакрилового полимера 01 .